一种道德病害的药剂番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

一种道德病害的药剂番茄细菌性斑点病病原菌鉴定

番茄细菌病（pse）位于年轻的番茄细菌病中，由dye和wilkie引起的。寄主为番茄(Lycopersiconesculentum)和辣椒(Capsicumannuum),接种寄主为茄子(Solanummelongena)和马铃薯(Solanumtuberosum)。番茄细菌性斑点病主要为害番茄叶、茎、花、叶柄和果实。自1933年首次报道以来,番茄细菌性斑点病在美国、英国、前苏联、加拿大、法国、南非、澳大利亚等26个国家和中国的台湾省有发生报道。Yunis(1980)报道,该病可造成番茄5%~75%的产量损失。Bonn(1980)和Conlin(1983)报道了美国部分州番茄受害情况。番茄细菌性斑点病我国只在台湾有记载。国外对该病有大量的研究报道,研究涉及病原形态、检验技术、发病规律、品种抗病性、病害防治和病原与寄主互作的分子生物学等,现已经克隆到了番茄的抗病基因pto。1998~1999年,我们在吉林省长春郊区的大棚番茄上发现一种病害,症状表现为报道过的病菌鉴定确定该病为番茄细菌性斑点病。经调查,1998年长春郊区宏明乡种植的佳粉15号发病率85%;1999年长春郊区齐家乡种植的吉粉2号发病率15%~56%,L409发病率58%~95%,利生7号发病率91%,908发病率58%;1999年盘锦市大棚番茄上也发现同类症状的病害,20%的大棚番茄发病,发病株率达50%以上,甚至毁棚。从1998~1999年的发病情况看,该病有蔓延和加重的趋势。1999年我们从吉林省、辽宁省和黑龙江省分离到了23个菌株并测定了致病性,接种后发病症状与田间自然发病症状完全一致,接种发病后又分离到病原细菌。本文对获得的23个菌株进行了病原菌鉴定,结果报道如下。1材料和方法1.1材料表面1.1.1纯化前后获得的表1供试的23个菌株是1999年从吉林省、辽宁省、黑龙江省等地番茄病株上分离并经纯化后获得的(表1)。对照菌株为番茄细菌性斑点病典型株系PDDCC2844-87(Pseudomonassyringaepv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie)。1.1.2试验植物致病性测定用感病番茄品种吉粉2号。接种寄主测定用4~6叶期的辣椒、茄子、马铃薯、龙葵、毛曼陀罗、白花曼陀罗和酸浆。1.1.3培养基分离培养用的是KB培养基。1.2方法1.2.1研磨法纯化菌株用灭菌解剖刀切取病健交界部位组织,用75%酒精消毒2min,经无菌水冲洗后置于小瓷皿中研磨,加无菌水浸20~30min,然后用接种环蘸取该组织液在KB培养基上划线。长出单菌落后用该培养基再划一次线使细菌纯化。纯化后用于致病性测定和病原菌的鉴定。1.2.2烟草叶片抗菌剂用量测定将从各地分离获得的23个菌株(表1)经纯化后在KB培养基上培养24h,以无菌水配制成细菌悬浮液,浓度为1×108cfu/ml,采用注射法接种到烟草叶片上,在25~28℃下保持24h,调查过敏性反应。1.2.3马铃薯薯块腐败测定马铃薯腐败试验是在无菌条件下把马铃薯切成片状,将在KB培养基上培养24h的细菌,在无菌条件下用接种环接到块茎上,调查马铃薯薯块腐败情况。1.2.4病原菌发病情况的测定在无菌栽培的吉粉2号番茄苗上接种。把各菌株配成3×108个/ml的新鲜菌悬液,喷雾接种到6~7叶期的番茄叶片上,以无菌水喷雾作对照,然后置于保湿桶内,保湿3d,第4d揭盖、夜间保湿,鉴定时温度在15~30℃之间,第15d调查发病情况。1.2.5菌株鉴定方法细菌的革兰氏染色反应、形态特性、培养性状及生理生化反应和G+Cmol%等项实验方法,主要参照《植物病害研究方法》,《一般细菌常用鉴定方法》,N.W.Schaad编著的《植物病原细菌鉴定实验指南》,《植物病原细菌的分类和鉴定》,《Bergey细菌系统手册》等书中方法进行。2试验结果2.1细菌、菌株的分离和疾病的测定2.1.1细菌的分离共获得了23株细菌(表1)。纯化后用于致病性测定和病原菌的鉴定。2.1.2过敏反应注射部位均表现过敏性枯斑反应(HR),这证明了其对植物有致病作用。2.1.3福田腐败结果供试菌株均没有引起马铃薯薯块腐败。2.1.4叶部和茎部感染第5d出现症状,第15d调查发病症状(表1)。番茄细菌性斑点病叶片感染,产生深褐色至黑色斑点,不规则,直径2~4mm,斑点周围有黄色晕圈。叶柄和茎秆症状和叶部症状相似,产生黑色斑点,但病斑周围无黄色晕圈,病斑易连成斑块。发病后再分离,获得了原接种的病原细菌。2.2核电站细菌的鉴定2.2.1致病性的细菌形态供试菌株的菌体呈短杆状,大小为0.5~1.0μm×1.5~5.0μm,有1至数根极生鞭毛,无荚膜,无芽孢,革兰氏染色阴性。2.2.2菌落形状和大小供试的菌株在KB培养基上28℃培养2d,形成圆形菌落,乳白色,全缘,不透明,表面光滑,粘稠状,菌落直径2~3mm。有黄绿色荧光。在YDC培养基上菌落白色。供试菌株生长不要求生长因素。2.2.3菌株的碳源利用试验结果生理生化性状见表2。从表2可知,供试菌株与对照菌株的试验结果一致,超过41℃则不能生长,耐盐性为5%,严格好氧,无冰核活性。果聚糖产生、明胶液化、吐温80分解、石蕊牛乳、葡萄糖氧化发酵、蔗糖还原物质产生、配糖体分解、氨的产生、核糖核酸酶、过氧化氢酶和脲酶均呈阳性;PHB积累、产H2S、吲哚、淀粉和果胶水解、3-酮基乳糖产生、乙酰甲基甲醇、甲基红、硝酸盐还原反应、葡萄糖酸氧化、脱氮、氨基酸脱羧酶、苯丙氨酸脱氨酶、卵磷脂酶、酪氨酸酶、精氨酸双水解和酪蛋白消化反应均为阴性。碳源利用试验结果:各菌株能利用D-葡萄糖、D-木糖、丙三醇、山梨醇、肌醇、甘露醇、乳酸、甜菜碱、奎尼酸、乙酸、L-苹果酸、葫芦巴碱、α-酮戊二酸、酪氨酸;不能利用D-阿拉伯糖、麦芽糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、鼠李糖、赤藓醇、邻氨基苯甲酸、苯甲酸、高丝氨酸、L-酒石酸、抗坏血酸、组氨酸。试验各菌株对丙酸的利用结果不一致。按分子克隆的方法分别提取PST27和PDDCC2844-87的总DNA,用热变性法在LambdaBio20紫外分光光度计上测定G+Cmol%(0.1×SSC),PST27和2844-87的Tm值分别为80.758和80.859,按公式G+Cmol%=2.08Tm(x)-106.4计算,得PST27G+Cmol%为61.57;PDDCC2844-87的G+Cmol%为61.78。供试菌株与对照菌株的测定结果基本一致。喷雾接种辣椒、茄子、马铃薯、龙葵、毛曼陀罗、白花曼陀罗和酸浆的结果表明,病菌在接种条件下可以侵染茄子、辣椒,发病后再分离,获得了病原细菌,与文献记载一致;但对马铃薯接种未能成功,与文献记载不同。喷雾接种不侵染酸浆而能侵染龙葵、毛曼陀罗和白花曼陀罗,为首次报道。3供试菌株及结果根据上述致病性测定结果,供试23个菌株和对照PDDCC2844-87(Pseudomonassyringaepv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie)菌株分别接种番茄后均能发病,接种发病症状与田间自然发病症状相同,均与文献报道番茄细菌性斑点病症状一致。叶斑小,呈深褐色,直径2~4mm,斑点周围有黄色晕圈,有时连成片形成不规则的坏死斑。叶柄和茎秆症状和叶部症状相似,病斑有合并现象,但病斑周围无黄色晕圈。细菌性斑点病症状与番茄细菌性疮痂病(Xanthomonascampestrispv.vesicatoria(Doidge)的症状相似,应注意区分。供试23个菌株革兰氏染色阴性,无芽孢,无荚膜,菌体短杆状、直或稍弯、单细胞、大小为0.1~1μm×1.5~4μm,菌体极生鞭毛1~4根。在YDC培养基上菌落白色,接触酶阳性,对葡萄糖能氧化不能发酵,由此可以确定供试菌株为假单胞菌属细菌。根据供试23个菌株在KB培养基上产生绿色荧光色素,PHB阴性,不能利用D-阿拉伯糖,可以确定供试菌属于假单胞荧光类群。根据LOPAT试验,从蔗糖形成果聚糖(levanformation),氧化酶反应(oxidasereaction),马铃薯软腐试验(potatoeorringcapacity),精氨酸双水解酶(argininereaction)和烟草过敏反应(tobaccohypersensitivity)的结果+,-,-,-,+;不能利用纤维二糖、海藻糖、L-鼠李糖、蔗糖和苯甲酸;能利用甘露醇和山梨醇;葡萄糖酸氧化呈阴性反应;超过41℃不能生长,可以确定供试23个菌株为丁香假单胞菌组群(P.syringaeVarHall,1962)。依据菌体形态特征、培养性状、生理生化反应和冰核活性等70多项鉴定结果,供试菌株与对照菌株表现一致(表2),与有关文献报道相同。供试PST27菌株G+Cmol%为61.57,对照PDDCC2844-87菌株的G+Cmol%为61.78,供试菌株与对照菌株的测定结果基本一致。资料记载Pseudomonassyringae的DNA的G+Cmol%为59~61。一般认为同种不同菌株的DNA的G+Cmol%的差异不大于4%~5%,而同属不同种的差异不大于10%,本结果符合规定范围。综上所述可以确认,本文从东北三省分离到的23个供试菌株为丁香假单胞杆菌番茄致病变种(Pseudomonassyringaepv.tomato(Okabe)Young,Dye&Wilkie)。该病菌引起番茄细菌性斑点病(又称叶斑病)。病菌在接种条件下可以侵染茄子、辣椒,与文献记载一致;但对马铃薯接种未能成功,与文献记载不同,不知是与接种方法有关还是与马铃薯品种(品系)有关,或是因为我国大陆的番茄