冬虫夏草开放血脑屏障模型的建立

冬虫夏草开放血脑屏障模型的建立

中枢神经系统感染是神经科学的常见病。根据美国的研究，细菌脑炎的发病率为86000人，死亡率为10%。选择抗生素时，应考虑细菌、选定药物和脑损伤（bbb）的渗透性。正常情况下,BBB对进入中枢神经系统的分子具有选择性的通透作用。在脑膜有炎症时,BBB对多种物质包括蛋白质、离子的通透性增加,抗生素的渗透性也有所增加,例如β内酰胺类抗生素在正常脑膜、脑脊液(cerebrospinalfluid,CSF)中的浓度仅为血药浓度的0.5%~2%,在脑膜有炎症时渗透性增加,但疾病状态下的BBB开放缺乏可控性。已经发现,大约有10多种方法可以可逆性开放BBB,使药物透过率增加。梁美蓉等以伊文氏蓝对脑组织的蓝染程度为判断指标,发现冰片能增强伊文思蓝对脑组织的蓝染程度;刘启德等的研究表明大鼠灌服冰片后,能明显提高庆大霉素在脑内的浓度,提示冰片能提高BBB的通透性。但是冰片对BBB的是否具有开启能力,尚无相关报道。本研究旨在动态监测冰片开放BBB过程,并建立相应的CSF药物浓度曲线,获得冰片开放BBB的动态参数。1实验材料1.1菌株、培养基天然冰片(吉安地区林科所天然冰片厂),注射用丙戊酸钠(杭州赛诺菲圣德拉堡民生制药有限公司,批号J20040009),丙戊酸试剂盒(美国雅培公司,批号L4630QL00),肺炎链球菌菌株3型(购自中国药品生物制品检定所,批号31003),BBC血琼脂培养基。1.2主要设备全自动荧光偏振免疫分析仪(美国雅培公司);电子天平(上海天平仪器厂)。1.3实验动物日本大耳白兔(购自北京科宇动物养殖中心,动物合格证号:SCXK京2002-0005),体重(2.5±0.4)kg,雌雄兼用。2实验方法2.1药代动力学指标实验动物分为对照组、冰片组和脑膜炎组。采用丙戊酸钠作为了解BBB通透性的参考指标,以冰片作为开放BBB的药物。先静脉应用丙戊酸钠至血及CSF中浓度达稳态,继而给予冰片,观察CSF中丙戊酸钠浓度的变化,了解BBB开放的程度。2.2动物实验20%水合氯醛麻醉动物,血管穿刺针植入小脑延髓池(寰枕池),1ml注射器缓慢抽出清亮CSF0.15ml。2.3动物的致死量和输注丙戊酸钠后对大鼠进行2.8h的实验丙戊酸钠注射剂以40mg/kg的负荷剂量经一侧耳缘静脉注射5min,继之以15mg/(kg·h)的速度持续静脉输注,脑膜炎组动物接种细菌16~18h脑膜炎模型成功后给予丙戊酸钠。冰片以适量75%乙醇溶解,冰片组动物以冰片0.7g/kg的剂量灌胃,对照组和脑膜炎组动物灌服等量75%乙醇。2.4冰酒给药前后给药前后各时间点的影响经小脑延髓池留置管留取CSF标本,取样点分别为冰片给药前及给药后即刻、30min,1~14h(1次/h)。脑膜炎模型兔CSF标本立刻用10倍倍比稀释后行细菌计数。2.5丙酸钠浓度的测定荧光偏振免疫分析法(TDx法)测定CSF中丙戊酸钠浓度。2.6细胞培养和模型兔的制备动物接种前1d,将肺炎链球菌菌株接种于血琼脂培养基,在37℃5%CO2环境中生长过夜,再移种于VITALAER肉汤中,生长至对数生长中期收菌,用生理盐水冲洗2次,再稀释成105cfu/ml(colonyformingunits)。脑膜炎的诱导参照Dacey和Sande的报道改进,小脑延髓池穿刺,先移去100μlCSF,然后注入100μl含105cfu/ml混悬液。接种细菌16~18h后,根据动物反应、体温、CSF常规、CSF生化判断细菌性脑膜炎模型兔制备成功。脑膜炎模型成功后16~18h,采集CSF标本,稀释,接种于BBC血琼脂培养基上,检测CSF中的细菌浓度。2.7动物不同时间点丙戊酸钠浓度的变化规律采用SPSS12.0统计软件包进行统计描述,各组动物不同时间点丙戊酸钠浓度用均数±标准差表示,3组均数的比较进行方差分析(ANOVA),P<0.05有显著性差异。3结果3.1csf中丙戊酸钠的浓度对照组CSF中丙戊酸钠浓度自给药后0.5~14h基本保持稳定,冰片组CSF中丙戊酸钠浓度在0.5h时即高于对照组,并逐渐上升,6h时达高峰,然后开始下降,14h时浓度仍高于对照组。脑膜炎组CSF中丙戊酸钠浓度基本保持稳定,但浓度高于对照组而低于冰片组(见表1)。3.2两组患者发生时间点的差别通过对3组间在不同时间点丙戊酸钠平均浓度的比较,发现冰片组与对照组在0.5h,1h,12h,13h,14h时间点差异无统计学意义(P﹥0.05);在2~11h时间点差别有显著意义(P﹤0.05),在6h的P﹤0.01。冰片组和脑膜炎组在4~8h时间点差别具有显著意义(P﹤0.05)。对照组和脑膜炎组在各时间点差异均无统计学意义(P﹥0.05)。6h的冰片组脑脊液浓度比对照组明显提高98.6%,比脑膜炎组提高52.0%,脑膜炎组比对照组仅提高30.7%.4各药物的开放程度有关BBB的研究已有一个多世纪的历史,它是脑与血液及脑脊液之间的一种屏障,与中枢神经的变性、损伤和炎症密切相关。目前,新的细胞培养技术和超细显微镜显示器功能的改良,使BBB研究的发展极为迅速,对BBB功能的探讨也更为深入。对BBB变化的探讨,不仅是了解神经系统疾病发生的基础,也对BBB紧密连接的选择性开放为不能通过血脑屏障的药物进入脑内创造条件。正常情况下,BBB对进入中枢神经系统的分子具有选择性的通透作用,对脑组织起到很好的保护作用,但是也限制了药物的进入,致使许多药物难以在脑组织中达到有效浓度,而不能充分发挥疗效。BBB限制了许多药物进入脑实质,故寻找克服BBB或促进药物透过BBB的方法十分重要。国内外许多医药学专家这方面做了大量相关研究。目前可采用的方法有经鼻腔给药、改变药物的化学结构、脑植入疗法、利用某些物质开放BBB促进药物进入脑组织等。如Freg等比较了125I标记的神经生长因子(NGF)的小鼠鼻腔给药和静注的结果,显示鼻腔给药和静注后血中浓度相当,但鼻腔给药脑内浓度是静注的2000倍(2.0∶0.001nmol/L)。Alyaudtin等将六肽dalargin吸附于吐温80包被的聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒静脉注射小鼠后,能够产生止痛作用,说明纳米粒能够携带药物进入脑部,还可采取鞘内或脑室穿刺直接给药,此法使药物不经过BBB,直接将药物注射于脑内,效果肯定,但由于技术操作要求较高,又容易感染,限制了此法的应用。脑膜有炎症时渗透性增加,但BBB开放的程度差别较大,且随着感染的好转,BBB逐渐恢复,妨碍了以后抗感染药物的进入。所以,疾病状态下的BBB开放缺乏可控性。20世纪七八十年代国内外有学者对高渗性脱水剂开启BBB的问题做了研究,美国Rapoport等人报道可用于渗透性BBB开启的高渗剂有阿拉伯糖、尿素、乳酰胺、甘露醇等。薛洪利等使用罂粟碱在大鼠身上进行了可逆性开放BBB的研究。但所筛选的药物多数由于其毒副作用,不宜长期使用。其它途径方面,高血压、电离辐射、高温环境、高压氧、冰冻等因素也均能通过不同的作用机制影响BBB的通透性,但上述物质及方法均难以开发成药。我国的中医药中如麝香、薄荷醇、冰片等开窍醒目的药物,已有报道冰片能增强伊文思蓝对脑组织的蓝染程度,促进庆大霉素、顺铂、磺胺嘧啶、造影剂泛影葡胺等透过BBB,但文献中未详细观察冰片开放BBB的药效动力学。本研究结果提示,冰片确实能明显增加BBB对丙戊酸钠的通透性,作用是可逆的,而且通过不同时间点的连续