茵陈蒿汤对dmn模型大鼠血清cdeccl4表达的影响

茵陈蒿汤对dmn模型大鼠血清cdeccl4表达的影响

“辨证论治”是中医学的核心内容和灵魂。辨证论治在临床诊疗中分为辨证、立法、选方、遣药四个环节,“证、法、方、药”有机统一,即据证立法,依法选方或遣药组方。“方证相应”是指一个方剂内的药味及其配伍关系与其针对的病证病机或病理环节之间具有高度相关性或反应性。“方证相应”强调了方药与其作用对象病证之间的相互作用,即方剂的功用是特定方药与其作用对象特定病证之间相互作用的结果。那么方剂在改善患病个体自身感受及整体病理反应状态的同时,对疾病(证)的特征性病理变化的影响如何?“方-效-证”相结合的疑难疾病的基础研究,能将现代医学和中医的辨证论治精华更好地结合起来,可能为中医现代化发展探索一条可行之路。肝硬化是多种慢性肝脏疾病的终末阶段,以弥漫性肝纤维化伴异常结节形成为其形态学特征,严重影响人类健康。目前尚无有效的抗肝纤维化的化学或生物药物进入临床应用。近年来,中医药整体观念(系统论方法)指导下的病证结合、辨证论治治疗模式对解决这一难题逐渐彰显出理论特色和临床优势,不但能改善临床症状及肝功能,显著提高患者的生活质量,而且在抑制肝脏炎症反应及纤维组织增生,促进肝纤维化的逆转等方面显示出优势,已经成为国内肝病研究领域的热点之一。体内、外实验研究表明,中药复方具有多途径(包括对纤维增生刺激因子、胶原及白蛋白基因表达等的影响),多靶点的综合作用。但由于以往研究缺乏建立在科学实验基础上的病-证相关性研究和针对肝硬化中医证候病机的基本治法、方剂的系统对照比较研究,中医学辨证论治的优势并未得到充分的展示。如何进一步发挥中医学的思维优势,针对肝硬化中医基本证候病机进行代表方剂系统比较的实验研究,探讨疾病(肝硬化)、中医证候病机及显效方剂之间的相关性(“方-效-证”相关性),不仅在提高临床疗效方面具有重要的实际价值,对促进中医理论的创新与发展同样具有重要的科学意义。本研究制备四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)和二甲基亚硝胺(dimethylnitrosamine,DMN)诱导的肝硬化大鼠模型,各模型动物采用具有清热利湿作用的茵陈蒿汤(《伤寒论》:茵陈、栀子、大黄)干预治疗,并采用国际惯用的小柴胡汤(《伤寒论》)作为对照,通过观察动物的整体状况、肝功能、病理组织学、肝组织羟脯氨酸(hydroxyproline,Hyp)含量,综合判断茵陈蒿汤的干预治疗效果,对茵陈蒿汤对不同模型的药效学进行横向比较,明确茵陈蒿汤对不同造模因子所致的同一疾病不同动物模型(证候)的疗效特点及对凋亡通路的影响。1材料和方法1.1血清指标测定CCl4,分析纯,购自中国医药集团上海化学试剂公司,批号为20021219;橄榄油,购自中国医药集团上海化学试剂公司,批号为20020819;DMN,购自日本东京化成株式会社(批号:MAL05)。血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase,ALT)测定试剂盒,批号为20031011;血清天冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase,AST)测定试剂盒,批号为20031021;血清白蛋白(albumin,ALB)测定试剂盒,批号为20031101;血清总胆红素(totalbilirubin,TBil)测定试剂盒,批号为20031001,均购自卫生部上海生物制品研究所。血清γ-谷氨酰转移酶(gamma-glutamyltransferase,GGT)检测试剂盒,购自南京建成生物工程研究所,批号为20021103。对二甲基氨基苯甲醛(P-dimethylaminobenzal),购自上海三爱思试剂有限公司,批号为20031224。氯氨-T(chloramines-T),购自中国医药(集团)上海化学试剂公司,批号为20030510。Hyp标准品,购自日本Nakatitesuku株式会社,批号为MIR8282。TRIzol、杂交试剂盒、体外转录的标记试剂盒、单循环cDNA合成试剂盒、生物素化抗体、链霉素和藻红蛋白等试剂及基因芯片扫描仪3000、基因芯片洗涤工作站(AffymetrixFluidicsStation450)、Affymetrix基因芯片杂交炉640、GeneChip·操作软件1.2等仪器、软件均由上海生物芯片公司提供。1.2制备1.2.1成汁、、浸膏、药汁茵陈蒿汤方出《伤寒论》,由茵陈蒿(ArtemisiacapillarisThunb.,山西)18g、栀子(GardeniajasminoidesEllis,浙江)10g、大黄(掌叶大黄,RheumpalmatumL.,产于青海同仁)6g组成。将栀子(1kg)与大黄(0.6kg)制成粗粉末,与茵陈蒿(1.8kg)一起水煎两次,药汁浓缩成浸膏,真空干燥后冷藏保存。生药总重量为3.4kg,真空干燥后重量为0.565kg,每克含生药6.018g。1.2.2药品的生产及用量小柴胡汤方出《伤寒论》,使用日本Tsumura株式会社生产的颗粒剂(TJ-9颗粒剂,成人每日用量7.5g),每克含生药5.45g,批号为20054732,为对照药物。1.3实验方法1.3.1实验动物中心雄性Wistar大鼠140只,体质量160~200g,购自中国科学院上海实验动物中心,许可证号为SCXK(沪)2003-0003。在上海中医药大学实验动物中心饲养、造模和观察,大鼠自由摄食。1.3.1.小柴胡汤、艾陈蒿汤分组参照文献方法。生理盐水稀释DMN为0.5%(v/v)浓度,以2mL/kg大鼠体质量剂量,每日1次腹腔注射,每周连续3d,共4周;造模4周后随机处死模型大鼠及同期正常对照大鼠各5只(干预用药前对照),将其余模型大鼠随机分为模型组(22只),茵陈蒿汤组(12只)和小柴胡汤组(15只),并开始用药治疗。经口给药(按照65kg体质量成人临床等效剂量的8倍)2周,茵陈蒿汤0.695g/kg(相当于生药4.185g/kg),小柴胡汤颗粒剂0.923g/kg(相当于生药5.03g/kg),大鼠按照10mL/kg体质量来灌胃给药,用药干预至6周末;正常和模型对照组给予等体积的蒸馏水,用药干预至6周末。1.3.1.各组大鼠的给药及对ccl4染毒的影响参照文献方法。50%CCl4-橄榄油溶液,2mL/kg大鼠体质量皮下注射,每周2次,共12周。造模8周后随机处死模型大鼠及同期正常对照大鼠各6只(干预用药前对照),将其余模型大鼠随机分为模型组(10只),茵陈蒿汤组(10只)和小柴胡汤组(10只),并开始用药治疗(给药剂量同上)4周,正常和模型对照组给予等体积的蒸馏水,同时继续予以CCl4染毒直至12周末。1.3.2样品采集和处理1.3.3观察指标1.3.3.胶原纤维束放散和活性测定肝组织病理:苏木精和伊红染色,光学显微镜下观察并作图像分析。肝组织胶原纤维增生程度分期评分标准:0期,正常肝脏,无明显胶原纤维增生;Ⅰ期,胶原纤维增生,中央静脉和门脉区有少量星芒状胶原纤维束放散,但无间隔形成;Ⅱ期,胶原纤维增生,中央静脉和门脉区结缔组织变厚,由此向四周伸出纤维索,形成不完全间隔;Ⅲ期,胶原纤维大量增生,有个别菲薄的完全间隔形成;Ⅳ期,粗大的完全纤维间隔及大量假小叶形成。采用试剂盒检测肝功能。血清总蛋白、白蛋白含量,溴甲酚绿法;血清TBil含量,重氮法;血清ALT、AST活性,赖氏法;GGT活性,按照南京建成生物制品研究所试剂盒说明书测定。肝组织Hyp(胶原蛋白)含量采用Jamall法。1.3.3.测量方法与数据处理提取各组肝脏总RNA,纯化,合成cDNA,纯化,生物素标记cRNA,片断化cRNA,杂交,洗脱、染色、扫描芯片。基因芯片:AfymetrixRat2302.0基因表达谱芯片,共载基因探针31099个。RNA的抽提采用TRIzol试剂盒。用纯化的RNA合成双链cDNA,生物素标记的cRNA的合成参考BioArrayTMHighYieldTMRNA转录标记试剂盒方法。将cRNA片段杂交于AfymetrixRat2302.0芯片。基因芯片的数据处理:首先将信号进行标准化和基于模型的表达指数(model-basedexpressionindex,MBEI)分析,得出校正后的数值,用于差异基因分析。特征性基因表达谱分析采用聚类分析法。特征性基因的筛选采用Foldchange法,两个芯片的每个基因之间倍数通过表达指数比值得出,以识别特征性基因,并用MBEI的标准误差来计算倍数的可信区间,本研究在组间进行比较时,以倍数的可信下限(1owerbound)作为基因表达上调或下调的评判标准。1.4计学分析采用SPSS12.0统计软件进行统计学分析。计量资料数据以表示,采用单因素方差分析进行组间比较,组间两两比较采用q检验,等级资料采用Ridit分析。2结果2.1不同造模时间对大鼠肝组织hyp的影响在DMN模型中,药物干预治疗前模型组大鼠死亡1只;与正常大鼠比较,随着造模时间的延长,模型大鼠血清ALTAST、GGT活性和TBil含量逐渐升高,均于4周时达到高峰(P<0.01);血清Alb含量逐渐降低,4周时降至最低(P<0.01);与6周模型对照组比较,茵陈蒿汤组大鼠血清ALT、AST和GGT活性及TBil含量显著降低(P<0.05或P<0.01),血清ALB含量显著升高(P<0.05)。CCl4模型中,药物干预治疗前模型组大鼠死亡5只,干预治疗后小柴胡汤组死亡2只;与正常大鼠比较,随着造模时间的延长,大鼠血清ALT、AST、GGT活性和TBil含量逐渐升高,均于12周时达到高峰(P<0.01);与此相反,模型大鼠血清Alb含量逐渐降低,12周时降至最低(P<0.01)。与12周模型组比较,茵陈蒿汤显著降低ALT、AST和GGT活性(P<0.05),但对TBil和ALB含量的改善作用不明显。见表1。正常大鼠肝小叶结构清晰,肝细胞索由中央静脉向四周呈放射状排列,其间有不规则的肝窦,中央静脉及汇管区结构正常(图1A)。DMN染毒4周末,肝内仍有较大面积的出血性病变,可见典型的桥状坏死,残存肝细胞明显肿胀,胞浆疏松,汇管区明显增宽,纤维间隔粗大、致密,形成大量大小不等的假小叶(图1C)。6周时模型大鼠肝内仍有散在出血,炎症细胞浸润减少,肝细胞肿胀减轻,肝细胞索排列仍较紊乱,纤维间隔较4周时变细,但仍有完全间隔存在(图1D)。与6周模型大鼠比较,茵陈蒿汤组肝细胞形态接近正常大鼠,肝细胞变性、坏死极少,可见较多的肝细胞增生、分裂现象,肝细胞索排列较为有序,肝窦较清晰,窦壁细胞增生仍较明显;纤维结缔组织疏松、纤细、不连续,纤维束内的成纤维细胞减少(图1)。CCl4染毒12周后,正常肝小叶结构完全被破坏,大量的纤维结缔组织增生,形成大小不一的典型的假小叶结构,假小叶内以脂肪变的肝细胞为主(图2D);间隔内可见大量的成纤维细胞和炎症细胞浸润,胆管损害严重,极少能见到正常的胆管样结构,有大量小胆管增生(图2D)。与12周模型对照组比较,茵陈蒿汤组、小柴胡汤组肝组织病理无明显改善(图2)。肝纤维化程度分布见表2。DMN诱导大鼠肝硬化后,随着造模时间延长,模型大鼠肝组织Hyp含量逐渐升高,4周时达到高峰;停止造模后,模型组大鼠肝组织Hyp含量略有下降。与6周模型组比较,茵陈蒿汤大鼠肝组织Hyp含量显著降低(45.57%)(P<0.01,见表2)。在CCl4模型中,与正常大鼠比较,4、8和12周时模型大鼠肝组织Hyp含量随造模时间延长显著升高(P<0.01)。与12周模型对照组比较,茵陈蒿汤组、小柴胡汤组Hyp含量有降低趋势,但差异均无统计学意义(P>0.05,见表2)。2.2ccl4模型大鼠caspase-12表达全基因组基因芯片显示,DMN和CCl4诱导的肝硬化(动态)模型基因的改变是不同的,而茵陈蒿汤对两个模型的基因调控也有显著差异(图3~10)。DMN造模2周后,模型组大鼠肝组织干扰素调节因子1(interferonregulatoryfactor-1,IRF-1)、Fas与Bax基因表达即显著上调,分别为正常组的2.24倍、2.89倍和1.9倍,4周时IRF-1略有下降,而Fas与Bax基因表达继续升高至正常组的3.42倍和2.68倍,停止造模后,IRF-1与Bax基因迅速下调,而Fas基因仍较正常组高2.04倍,茵陈蒿汤显著抑制Fax、Bax和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(caspase-3)的表达,促进Bcl-xl和肝细胞生长因子的表达。在CCl4模型中,随着造模时间的延长,肝细胞凋亡指数逐渐增加,且不同时间点(4、8和12周)模型之间比较差异均具有统计学意义(数据略);基因芯片结果显示,caspase-12在正常组不表达,造模4周时可检测到表达,随着肝纤维化的加重表达逐渐升高,12周时分别为4周和8周的1.54倍和2.31倍;在肝硬化形成过程中,caspase-3、caspase-8表达也有不同程度的上调;凋亡通路分析显示,凋亡受体通路的Fas和线粒体凋亡通路的活化因子Myc基因表达持续显著上调,且12周时核转录因子κB(nuclearfactor-κB,NF-κB)基因表达亦显著上调。抗凋亡因子Bcl-2基因在正常组表达,而造模12周时不表达,同时肝脏蛋白质组差异表达研究显示CCl4造模12周后模型大鼠有caspase-12蛋白表达。茵陈蒿汤未能抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡,虽然也抑制caspase-12的表达,但与模型组比较无明显差异,也未能明显抑制内质网细胞凋亡通路。3不同模型的凋亡及对ccl4大鼠对细胞凋亡的活性判断研究发现,尽管茵陈蒿汤对DMN(4周造模)和CCl4(12周造模)两种大鼠肝硬化模型都表现出了疗效,但却不尽相同,对DMN模型的干预尤其是降低肝组织羟脯氨酸含量、改善肝组织病理变化的作用显著优于CCl4模型。全基因组基因芯片显示,DMN和CCl4诱导的肝硬化模型基因的改变是不同而且是差异巨大的,茵陈蒿汤对两个模型的基因调控也有显著差异。进一步的机制研究表明,茵陈蒿汤对DMN和CCl4肝硬化模型的过氧化损伤、肝细胞凋亡和胶原代谢等均呈现了不同的干预作用。肝细胞凋亡是肝脏损伤的基本要素之一,也是多种慢性肝病的共同病理特征。在DMN诱导的大鼠急性肝损伤中,大剂量单次注射DMN3h后电子显微镜下即发现小叶中央区出现凋亡肝细胞。已有研究表明在CCl4大鼠肝纤维化模型中也有大量的肝细胞凋亡。我们的研究显示CCl4和DMN诱导的大鼠肝纤维化进展期均存在大量的肝细胞凋亡。正常大鼠肝细胞的凋亡率很低,DMN染毒后模型大鼠肝细胞凋亡指数显著升高,于造模2周时达到高峰,此后逐渐减少,但仍显著高于正常组,表明肝细胞的病理性凋亡是DMN大鼠肝硬化形成过程中一个突出的病理现象。促进细胞凋亡的基因均在模型进展期逐渐高表达,提示肝细胞凋亡在DMN和CCl4大鼠肝硬化形成中发挥重要作用。研究表明茵陈蒿汤不仅可抑制TGF-β1诱导的肿瘤细胞株McA-RH8994凋亡,也可抑制TGF-β1诱导的肝细胞凋亡,而在TGF-β1处理7h后,茵陈炔酮和茵陈炔烯(茵陈蒿汤主要成分)仍表现出相同程度的抑制细胞凋亡的活性,表明它们不是阻碍TGF-β1与受体的结合,而可能是作用于细胞死亡的过程。进一步研究发现预先以都桷子素处理可以抑制Jo2诱导的急性肝损伤小鼠肝组织中caspase-3、8的活化,增强肝线粒体对Ca2+诱导的MPT(线粒体渗透性转变)的抵抗。我们的研究结果揭示茵陈蒿汤对两个模型的细胞凋亡显示了不同的甚至截然相反的作用。在DMN大鼠肝硬化模型中,茵陈蒿汤组大鼠的肝细胞凋亡指数显著低于4周模型组。基因芯片和Westernblotting(数据略)实验结果表明,茵陈蒿汤显著抑制Fas、Bax、caspase-3的表达,促进Bcl-xl和肝细胞生长因子的表达。在CCl4模型中,茵陈蒿汤没有显著抑制CCl4诱导的肝细胞凋亡,虽然也抑制caspase-12的表达,但与模型组没有显著差异,没有明显抑制ER细胞凋亡通路,反而促使酪氨酸激酶受体(在肿瘤血管形成中发挥着关键作用)上调了4.8倍。为什么茵陈蒿汤对不同的造模因子制备的同一疾病的经典模型的治疗作用是截然不同的呢?同一方剂对这两个肝硬化模型却产生不同疗效的病理基础是什么呢?DMN和CCl4肝硬化模型肝细胞凋