微藻生物柴油技术发展与应用

微藻生物柴油技术发展与应用

能源是可持续经济发展的动力，石化燃料资源的日益匮乏给全球经济发展带来了危机。《中国能源发展报告(2011)》指出:“十一五”期间,中国能源消费总量达到32.5亿t标准煤,年均增长6.6%,到2010年已成为世界第一大能源消费国。中国原油进口量从2005年的1.27亿t增加到2010年的1.6亿t,对外依存度接近55%。这给我国能源安全带来了巨大的威胁,因此发展新型能源具有非常重要的意义。生物质能源作为新型能源的典型代表已引起了越来越多科研人员的广泛关注。作为生物质能源,微藻被认为是一种极具潜力的生物柴油原料。微藻具有光合效率高,零净碳值,细胞增殖快,生产周期短,所需的培养基来源丰富,所产的油脂成分与植物油类似,并且不与农争地、不与人争粮、不影响全球能源分配等优点。利用微藻生产生物柴油的工艺过程包括微藻的规模培养、细胞采收、油脂提取及生物柴油转化等环节。其中微藻油脂的提取是影响微藻生物柴油技术产业化和生产成本的关键步骤之一。本文对近10年来微藻油脂制取过程中藻种的选择、微藻细胞破壁方法以及微藻油脂提取技术方面的研究进展进行了综述。1富油微藻细胞油脂含量高的优良藻种是有效提取微藻油脂的前提。众多科研人员研究发现,油脂含量较高的微藻主要集中在绿藻、硅藻、金藻等真核微藻。常见的富油微藻主要有葡萄藻(绿藻)、小球藻(绿藻)、杜氏藻(绿藻)、三角褐指藻(硅藻)等。在某些情况下,尤其是逆境条件下(如氮短缺等),这些微藻细胞会大量积累油脂,主要是甘油三酯(葡萄藻则是积累烃类油脂)。常见富油微藻藻种的油脂含量如表1所示。2藻细胞油脂提取法由于微藻油脂大多存在于藻体细胞内,而且部分油脂以与蛋白质或糖类结合的脂蛋白或脂多糖的形式存在,藻体细胞被较为坚韧的细胞壁所包裹,较难直接将油脂提取出来。因此,在油脂提取前需要对藻体进行破壁预处理。常见的预处理方法主要分为物理、化学和生物化学破壁法。2.1反复冻融法破碎细胞的研究微藻的物理破壁法主要包括高压均质法、研磨法、反复冻融法、超声波破壁法、微波破壁法以及脉冲电场破壁法。高压均质是指微藻细胞在通过工作阀的过程中,在高压下产生强烈的剪切、撞击、空穴和湍流涡作用,从而使细胞得到破碎。在此过程中细胞的破碎程度与所用压力、微藻细胞壁结构以及细胞大小有关。Halim等在压力为85MPa条件下对Chlorococcumsp.微藻进行高压均质破壁处理,细胞破碎率达到73.8%。采用高压均质具有破壁率高的特点,但所耗的能量较大,是一种能源密集型技术。研磨法是一种机械破壁方法,其原理是将微藻细胞与研磨剂(小珠)混合,通过高速研磨或搅拌,使微藻细胞与坚硬的研磨剂充分接触,从而达到破壁的效果。Zheng等将Chlorellavulgaris微藻与0.4~0.6mm的玻璃珠研磨剂混合,在旋转速度1500r/min的条件下破壁300min,Chlorellavulgaris微藻油脂的提取率达到10%,表明该法对微藻细胞有一定的破碎效果。Halim等在对微藻破壁方法的研究中发现,采用研磨法可使Chlorococcumsp.微藻平均细胞破碎率达到17.5%。研磨法通常与有机溶剂提取法结合使用,当微藻细胞浓度高且提取产物易于分离时,采用研磨法是一种经济有效的预处理手段。反复冻融法破碎细胞主要是利用细胞内冰晶的形成和细胞液浓度增高引起溶胀。每次冻融在细胞内外形成冰晶的部位不一样,这样就能对细胞不同部位的细胞壁和细胞膜产生破坏,因而多次冻融能使破碎效果提高。陈伟平等利用反复冻融法对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻3种藻细胞进行破碎,结果表明紫球藻和蔷薇藻经反复冻融细胞破碎率高。Soni等采用反复冻融法提取四点颤藻藻胆蛋白,研究表明4次冻融可以提取出胞内大部分藻胆蛋白。王雪青等采用反复冻融法破碎17种微藻细胞,通过细胞破碎率检测破碎效果,结果表明经过2次冻融,10种微藻的破碎率在95%以上,4种在60%~80%,破碎效果与微藻细胞的种类、细胞壁组成等因素密切相关。反复冻融法具有方便、对热敏性物质没有损害、不受外源性杂质污染等优势,因而应用广泛。超声波破壁法是一种适合大多数藻细胞的破壁方法,其原理是超声波能够对媒质产生独特的机械振动作用和空化作用。当超声波振动时能产生并传播强大的能量,在液体中还会发生空化作用使其在液体内形成空化泡,若空化泡在微藻细胞壁附近破裂,就会破坏微藻细胞壁,使胞内物质释放出来。超声波对细胞破碎的效率与细胞种类、时间、细胞浓度和超声波的声频、声能有关。裴海燕等在研究藻细胞破碎对释放有机物特性的研究中发现,超声处理确实增加了微藻细胞内有机物的释放。孙利芹等研究了超声波对紫球藻的破碎效果,结果表明当输出功率150W、处理时间20min时,破碎率达到85%。王雪青等采用超声波法破碎17种微藻细胞,细胞破碎结果显示,经过12min的超声波处理,所有实验藻种的破碎率均在90%以上。超声波法具有破壁率高、处理时间短、对环境无污染等优点,但目前超声波处理对所提油脂品质的影响还不很清楚且很难应用到大规模生产中。微波破壁法的原理是微波加热导致细胞内的极性物质尤其是水分子吸收微波能,产生大量的热量,使胞内温度迅速上升,液态水汽化产生的压力将细胞膜和细胞壁冲破,形成微小的孔洞;进一步加热,导致细胞内部和细胞壁水分减少,细胞收缩,表面出现裂纹。Lee等用微波法对微藻原料进行预处理后提取微藻中的油脂,研究表明微波法是一种简单可行的预处理方法。Zheng等采用微波法对Chlorellavulgaris微藻进行破壁处理,研究表明微波破壁具有较好的破壁效果。微波破壁具有安全、快速等优点,但由于微波法能使细胞内产生大量热量,因此采用微波预处理可能会对所提油脂的品质产生不良影响。脉冲电场破壁法是利用高压脉冲电穿孔机理,在瞬间使细胞壁和细胞膜发生破坏。脉冲电场破壁法具有耗能少、处理时间短、不易引起蛋白质和核酸变性等优点,是一种新型的微藻破壁技术。目前,该技术运用于藻油提取的报道较少,但脉冲电场技术是一种极具发展潜力的微藻破壁技术。2.2酶法细胞破碎法微藻的化学与生物化学破壁法主要包括酸热法、化学渗透法、酶溶法等。酸热法是将微藻细胞与酸加热共煮一定时间,从而使细胞壁酸解破裂。Halim等在对微藻破壁方法的研究中发现,将Chlorococcumsp.微藻与8%的硫酸在160℃条件下共煮45min,可使微藻细胞的破壁率达到33.2%。化学渗透法则是使用有机溶剂或无机溶液来改变细胞壁的通透性,达到破壁效果。此法较为温和,但操作时间较长。陈伟平等利用低浓度氯化钙溶液对紫球藻、蔷薇藻和念珠藻3种藻细胞进行破碎,研究表明低浓度氯化钙对3种微藻都有一定的破壁效果,其中对念珠藻的破壁效果最明显。酶溶法通过各种水解酶将细胞壁分解,酶法细胞破碎技术不仅能提高胞内产物的提取效率、降低能耗,还能减少化学试剂的用量,有利于环保。何扩等在小球藻破壁技术的研究中发现,纤维素酶单独作用的最佳酶量为2%,复合酶作用的最佳酶量为1%。姜剑锋等对寇氏隐甲藻进行破壁研究,结果发现酶法破壁后能够提高微藻油脂的提取率,把酶法破壁和超声波法破壁结合起来,破壁率可高达91.7%。Zheng等采用酶解法对Chlorellavulgaris微藻进行破壁处理,发现酶解法的破壁效果明显优于研磨法等机械破壁方法。采用化学与生物化学破壁法具有破壁率高、能耗低等优点,但由于化学与生物化学破壁法需要引入化学试剂或酶制剂,在一定程度上会增加后期生产过程中产物分离与提纯的困难。3微藻细胞内的油脂的提取微藻细胞采用某些破壁方法预处理后,大部分油脂仍贮留在细胞内,需采用合适的方法将微藻细胞内的油脂进一步提取出来。目前常用的微藻油脂提取方法主要有:有机溶剂提取法、超临界萃取法、亚临界溶剂法以及耦合提取技术等。3.1微藻油脂的提取有机溶剂提取法是目前国内外广泛应用的微藻油脂提取技术。该技术应用固液萃取的原理,选用某种能够溶解油脂的有机溶剂,经过对微藻的接触(包括浸泡或喷淋等)使微藻油脂溶解在选定的溶剂中而被萃取出来。对选用的有机溶剂通常有以下几个要求:对油脂有较好溶解度、化学性质稳定、容易与油脂分离、安全性能好。实验室常用的提取溶剂主要有石油醚、正己烷、丙酮、氯仿、乙醇和甲醇等,也可利用混合溶剂提取微藻油脂。Ranjan等采用索氏提取法和Bligh-Dyer法提取微藻油脂,得出的结论是微藻油脂提取的机制是细胞扩散,并且发现溶剂的选择是影响微藻细胞中油脂扩散的主要因素。刘群等以石油醚/乙醚为溶剂提取球等鞭金藻海藻油,通过单因素实验和正交实验确定最佳提取工艺,得到的油脂提取率约为40.8%。刘圣臣等以小球藻为原料,采用乙醇作为溶剂提取海藻油,在最佳工艺条件下出油率达到24.28%。Hemanathan等利用正己烷提取海洋微藻中的油脂,油脂提取率为(45±4)%。日本电力工业中央研究院(CRIEPI)于2010年宣布了一种采用液化二甲醚在常温下有效提取海藻油的方法。该方法利用液化二甲醚能够与水和油混合的独特性,在室温下对海藻同时进行脱水和提油。与传统方式相比,不仅可减少脱水和干燥需要的能量,还可以减少所需的有机溶剂用量。此外,微藻油脂的提取还可采用直接皂化法和直接酯化法。直接皂化法即原料直接与醇碱溶液(KOH-CH3OH或KOH-C2H5OH)反应提取,该方法提取快速、简便,但脂肪酸的提取率比较低;直接酯化法是指原料与酯化试剂(乙酰氯或三氟化硼的醇溶液)进行酯交换,提取率较高,但酯化试剂通常毒性较大。采用有机溶剂法提取微藻中的油脂具有出油率高、容易实现大规模和自动化生产等优点,但由于有机溶剂通常具有挥发性和毒性,不利于人体健康和环保。因此,如何在微藻油脂提取过程中减少有机溶剂的使用已成为近年来的研究热点。3.2超临界流体萃取超临界萃取技术是近二三十年发展起来的一种新型分离技术,在超临界状态下,利用超临界流体具有的优良溶解性及这种溶解性随温度和压力变化而变化的原理,将超临界流体与待分离的物质接触,使其选择性地把不同极性大小、沸点高低和相对分子质量大小的成分依次萃取出来,借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体,被萃取物质则完全或基本析出,从而达到分离提纯的目的。超临界流体萃取过程是由萃取和分离两个过程组合而成的,一般用CO2作为萃取剂萃取油脂。超临界萃取的效果与压力、萃取温度、CO2流速以及萃取时间有关。程霜等确定了螺旋藻油超临界CO2萃取的最佳工艺条件:萃取压力25MPa,萃取温度40℃,萃取时间2h,在此条件下螺旋藻油的萃取率为95.3%。Andrich等研究了超临界萃取微绿球藻的动力学过程,在萃取条件55MPa,萃取温度40℃条件下,油脂提取率约为250mg/g。在超临界萃取过程中,加入少量乙醇作辅助溶剂,可以提高CO2的溶解度,降低萃取所需的温度与压力,达到更好的萃取效果。Mendes等用乙醇作辅助溶剂,采用超临界萃取法提取Arthrospira微藻中的油脂,发现油脂提取率与Bligh-Dyer法相当。超临界萃取法具有操作温度低、提油率高、环境污染小等优点,但是所需设备昂贵、提油过程耗能大、对操作条件要求高。3.3在微拟生物原料的萃取中的应用亚临界溶剂提取技术是一种新的加速萃取技术,其原理是将样品置于密闭容器中加温加压,通过升高压力提高溶剂的沸点,使溶剂在高于正常沸点的温度下仍处于液态,加速被提取物从原料颗粒基质中解析并快速进入溶剂。Young等利用离子液体萃取酵母和小球藻等生物原料的油脂,在离子液体中添加甲醇、乙酸、丙酮、氯仿等溶剂,使原来的萃取体系成为共溶剂体系,油脂萃取效率得到了显著提高。李植峰等在真菌油脂提取实验中发现,在氯仿、甲醇有机溶剂萃取的基础上加入酸,能大大缩短样品的处理时间,且油脂提取率优于超临界CO2萃取法。陈闽等用不同亚临界溶剂从微拟球藻湿藻泥中提取油脂,结果表明亚临界乙醇-正己烷溶剂对湿藻细胞有较高的油脂萃取率且消耗的溶剂少,若加入少量硫酸可进一步提高油脂的提取率,降低溶剂用量。由此可见,亚临界溶剂法提取微藻中的油脂具有速度快、所耗有机溶剂少、提油率高等优点。3.4联合法提取微藻油耦合法提取微藻油脂主要包括:超声辅助提取法、微波辅助提取法、脉冲电场辅助提取法以及酶提取法等微藻油脂提取技术。3.4.1利用科技强化提取超声辅助提取法是指利用超声波的热效应、机械效应和空化效应,强化溶剂提取过程,达到缩短提取时间,减少溶剂用量,提高油脂提取率的目的,是一种具有发展潜力的利用外力场强化提取的新技术。卢群等采用超声辅助提取小球藻(Chlorellasp.)中的油脂,结果表明利用超声波强化溶剂提取过程可缩短提取时间、提高溶剂利用率、减少溶剂用量、提高提油率。Cravotto等采用超声辅助溶剂法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以将油脂提取率从4.8%(索氏抽提法)提高到25.9%。3.4.2脂提取率的提取微波辅助提取法是指利用微波的热效应,在对微藻细胞进行破壁的同时,强化有机溶剂提取过程,达到缩短提取时间,减少溶剂用量,提高油脂提取率的目的。Cravotto等采用微波辅助法提取Crypthecodiniumcohnii微藻中的油脂,可以将油脂提取率从4.8%(索氏抽提法)提高到17.8%。Balasubramanian等采用微波辅助法提取Scenedesmusobliquus微藻中的油脂,提取率从47%(索氏抽提法)提高至77%,提取时间从10h缩短至20min,且提取的油脂质量较好。3.4.3微藻油脂的提取高压脉冲电场是一种新型的非热加工技术,利用高压脉冲电穿孔机理可以实现细胞膜的穿孔作用,对于提取细胞内的成分具有很好的作用效果。目前已经有不少报道将该技术应用于玉米油、大豆油、橄榄油等植物油的提取过程中,是一种具