二氧化碳加富对海洋微绿藻生长、光合和抗氧化酶活性的影响

二氧化碳加富对海洋微绿藻生长、光合和抗氧化酶活性的影响

1880年以前，b2全球浓度约为0.08%。随着工业的发展,人类的活动特别是矿物燃料的大量使用和植被的破坏,导致大气CO2浓度的持续上升,目前升到约0.036%。多数学者认为到21世纪中后期,大气CO2浓度可能倍增到约0.072%。海洋面积占地球表面总面积的71%,海洋所溶解的总碳量为大气CO2量的50倍以上,在全球碳循环中起着很重要的作用。据估计,海洋吸收工业排放CO2的30%~35%,是CO2的重要汇源。CO2浓度的升高必然会对海洋生态系统中食物链的初级生产者-藻类产生影响。近年来,CO2浓度升高对藻类的影响的研究已经取得了很大的进展。高CO2浓度与大型海藻生长的关系中,存在促进、抑制及没有影响等效应,这可能与不同海藻种类和实验条件有关。大气CO2浓度升高能提高海洋浮游植物的初级生产力。高CO2浓度将促进微藻的生长;提高光合作用;降低小球藻脂肪酸的不饱和度;但研究者又发现高浓度CO2培养条件下,其光合生理特征与通低浓度CO2相比,有明显的变化,主要表现在对CO2的亲和力下降,pH补偿点下降和CO2补偿点升高。CO2浓度升高对高等植物的抗氧化酶的影响已有不少研究,但对浮游植物的抗氧化酶的研究还未见报道,本文在研究CO2加富对两种海洋微藻的生长、光合作用的基础上,探讨了膜脂过氧化产物MDA含量及抗氧化酶活性的变化,以揭示CO2加富对微藻的作用机制。1材料和方法(1)微生物的制备和气体流量的测量所用小球藻(Chlorellasp.)和亚心形扁藻(Platymonassubcordiformis)由中国海洋大学水产学院微藻研究中心提供。海水取自鲁迅公园附近海滨,1.05kg/cm2灭菌20min,培养液选用f/2营养盐配方。对数生长期的藻细胞接入盛有200mlf/2培养基的1000ml的三角瓶中,接种浓度控制在OD695=0.200左右,实验置于光照培养箱中培养,光照强度为5000lx,光暗周期为12h:12h,温度为20±1℃,pH为8.0±0.1。一组通含360μl/LCO2的过滤空气,另一组通含有5000μl/LCO2的过滤空气,通气玻璃管距液面一定距离。气体流量用流量计(LZB-3,青岛华仪仪表厂,青岛)控制在300ml/min。整个实验中所用气体用钢瓶中的压缩空气(CO2浓度为360μl/L)和压缩混合空气(含有5000μl/LCO2的过滤空气)来维持(空气和混合空气由青岛合利气体工业中心提供,青岛)。(2)藻细胞计数细胞密度的测定用Lugol碘液固定样品,血球计数板计数。每天取微量藻液进行细胞计数。实验进行到第7天,收集藻样并对以下各种生理生化指标进行测定。(3)藻体的干重藻体被抽滤在0.45μm的微孔滤膜上,然后放在80℃的干燥箱中烘干72h,并用电子天平称其重量,总重量减去微孔滤膜的重量即为藻体的干重。(4)chla和car含量的测定(Chla)、类胡萝卜素(Car)含量和光合速率的测定Chla和Car含量测定参照Jensen方法进行,90%丙酮提取,UV-9100型分光光度计测定。光合速率的测定采用高尚德等的黑白瓶定氧法。(5)蛋白质含量的测定提取液采用磷酸缓冲液(pH7.0),对收集的藻细胞在冰浴中匀浆,TGL-16台式高速离心机上15000r/min离心15min,上清液即为蛋白质提取液。然后,按照Bradford的方法进行蛋白质含量的测定。以小牛血清白蛋白为标准曲线。(6)谷胱甘肽活性测定SOD采用Beauchamp建立的,Bewley等改进的氮蓝四唑(NBT)光化学反应法进行测定。一个SOD酶活力单位定义为能引起反应初速度(指不加酶提取液时)半抑制时的酶用量,即:SOD活性=(OD对照组-OD处理组)/50%OD对照组×样品稀释倍数。POD活性测定按照Kar和Choudhuri方法。反应液在28℃温育5min后加1ml5%H2SO4终止反应。离心后上清液在470nm比色。CAT活性测定按照Kato和Shimizu的方法通过测定H2O2的消失来测定CAT的活性。GR酶活性测定参考Rao等方法,反应体系成分为1mmol/LEDTA,5mmol/LGSSG,50mmol/LTris-HCl(pH7.8),1mmol/LNADPH,用1min催化还原1nmol的谷胱甘肽的酶量表示一个酶活性单位(1U=1nmol/min),用Ellman等的方法测定GSH。膜脂过氧化产物MDA含量的测定参照Heath和Packer的方法进行测定。(7)处理数据实验数据采用数理统计法将处理组与对照组差异进行显著性的t检验。2结果2.1cod对小球藻和亚所有权生长的影响由图1,图2可以看出,随着时间的延长,细胞数不断增长,另外,高浓度CO2(5000μl/L)的小球藻和亚心形扁藻的细胞数比低浓度CO2(360μl/L)的细胞数显著增长,且随时间的延长,增长幅度越大。所以,CO2加富能够促进小球藻和亚心形扁藻的生长。但两种藻之间存在差异,即CO2加富对两种藻的生物量增长的敏感性不同。根据实验数据建立低浓度CO2(360μl/L)与高浓度CO2(5000μl/L)条件下小球藻与亚心形扁藻的细胞密度(y)对时间(x)的回归方程,如表1。小球藻在5000μl/LCO2与360μl/LCO2的回归斜率之比:497.46:433.89=1.15;亚心形扁藻在5000μl/LCO2与360μl/LCO2的回归斜率之比:21.314:14.486=1.47。根据回归斜率之比小球藻(1.15)<亚心形扁藻(1.47)判断,CO2加富使亚心形扁藻生物量增长的速度比小球藻生物量增长的速度快,所以CO2加富对两种藻生物量影响的敏感性比较为:小球藻<亚心形扁藻。2.2亚体外藻和小球藻营养成分的测定结果主要表现由表2中可以看出,CO2浓度升高使亚心形扁藻和小球藻的干重比对照分别增加了11.87%和11.97%(P>0.05)。亚心形扁藻和小球藻的Chla含量在高浓度CO2(5000μl/L)与低浓度CO2(360μl/L)下相比,分别降低1.14%和9.95%,但变化不显著(P>0.05)。高浓度CO2亚心形扁藻的Car含量比低浓度CO2降低了2.39%(P>0.05),而小球藻的Car含量稍有所增加,增加了9.06%(P<0.05)。高浓度CO2的亚心形扁藻和小球藻的可溶性蛋白含量比低浓度CO2分别降低20.56%(P<0.05)和7.03%(P<0.05)。高浓度CO2的亚心形扁藻和小球藻的光合速率分别增加了72.6%(P<0.01)和59.5%(P<0.01)。另外,亚心形扁藻和小球藻之间存在种间差异。亚心形扁藻的Chla和Car含量为小球藻的4.1~4.9倍,而可溶性蛋白含量是小球藻的8.6~9.8倍;光合速率为小球藻的34.5~38.2倍。2.3co浓度对两种藻mda含量的影响两种藻的MDA含量存在种间差异,亚心形扁藻的MDA含量是小球藻的MDA含量的6.4~6.5倍(图3)。另外,随着CO2浓度的升高,两种藻的MDA含量都显著降低(图3)。高浓度CO2条件下的亚心形扁藻和小球藻的MDA含量比低浓度CO2分别降低了28.3%(P<0.05)和29.3%(P<0.05),表明CO2升高可以减轻微藻在大气CO2浓度下产生的膜脂过氧化损伤,有利于膜脂稳定性的保持。2.4亚储粮和小球藻对cat活性的影响随着CO2浓度升高,两种藻的SOD、CAT、GR活性显著降低(图4)。高浓度CO2条件下的亚心形扁藻和小球藻的SOD活性比对照分别降低了12.29%(P<0.05)和24.8%(P<0.05),而CAT的活性比对照分别降低了15.09%(P<0.05)和14.40%(P<0.05),高浓度CO2条件下的亚心形扁藻和小球藻的GR活性比低浓度CO2分别降低了30.22%(P<0.01)和11.68%(P<0.05),而POD活性稍有所升高但变化不显著。另外,亚心形扁藻和小球藻的抗氧化酶活性因藻种不同而差异很大,亚心形扁藻的抗氧化酶活性是小球藻的10~30倍。3生物酶活性的变化实验中所用小球藻细胞直径3~5μm,细胞个体比较小而且繁殖速度快;而亚心形扁藻细胞长11~16μm,宽7~9μm,厚3.5~5μm,繁殖速度比小球藻慢。光合速率、Chla含量和Car含量以及抗氧化酶活性因藻种差异而存在很大的差异。尽管品种差异很大,但变化趋势基本上是一致的,说明CO2加富的作用机理是相同的。CO2浓度升高促进亚心形扁藻和小球藻生物量的提高,这与夏建荣等的CO2浓度加倍对水华鱼腥藻的结果是相似的。本文的结果还显示,与大气CO2浓度条件下培养相比,CO2加富极显著地提高了光合作用速率,这与CO2加富培养导致藻细胞有较高的生物量是一致的。根据张其德等的结果,这可能是因为CO2加富有利于藻光系统Ⅱ的光化学效率的提高,光系统Ⅱ的光化学效率的提高有利于把所捕获的光能以更高的速度和效率转化为化学能,为光合碳同化提供更充足的能量,这可能是CO2加富有利于光合速率提高的原因之一。高CO2浓度使大型海藻的叶绿素a含量下降。但也有不同的结论,Johnston和Raven的实验结果表明,高CO2浓度培养的齿缘墨角藻中,叶绿素a水平与对照没有区别。本实验数据也表明叶绿素a和类胡萝卜素含量与对照相比没有太大变化。这可能是因为在通入高浓度CO2之后,叶绿体的数量明显增多,便于吸收更多的光能,但与此同时细胞数目急剧增加,而细胞不断分裂可能导致平均直径(体积)则急剧减少,所以光合色素含量变化不明显。本实验中CO2加富使得可溶性蛋白含量下降,这与Mercado等结果一致。可溶性蛋白质的下降,可能与CO2浓度升高使Rubisco含量的下降有关。MDA是不饱和脂肪酸过氧化产物之一,它的含量多少代表了膜脂过氧化的程度。本文结果显示CO2浓度升高使两种藻的MDA含量显著下降,这表明了高CO2对防止藻的氧化损伤具有一定的保护作用。当植物生长的外在条件如温度、湿度、土壤中的水分、盐浓度等发生积聚变化或当大气污染(如SO2、臭氧)、紫外线辐射、某些农药及病原体等作用于植物时,都会使植物体产生大量的活性氧(ReactiveOxygenSpecies,ROS),形成氧化损伤。这些比氧活泼的含氧化合物包括:超氧根阴离子(O2·-)、氢氧根离子(OH-)、羟自由基(·OH)、过氧化氢(H2O2)等。活性氧可以攻击蛋白质、膜脂和其它蛋白组分的损伤。生物体在进化过程中形成了各种各样的酶来解除光化学或光化学产物的毒性,如CAT能将H2O2转化为H2O和O2;SOD是一群含金属离子的酶,其功能是将O2·-歧化成H2O2和O2;GR是一种黄素酶,每分子酶蛋白含有一分子的FAD,由辅酶NADPH供氢,催化氧化型谷胱甘肽(GSSG),还原成还原型谷胱甘肽(GSH)。本实验中,CO2浓度升高显著降低了SOD、CAT和GR活性,而POD活性受CO2浓度影响不大(图4),SOD是一种诱导酶,因此SOD活性的降低代表了O2·-的产生速率的降低。CAT和GR活性的降低可能是因为微藻细胞内H2O2含量的降低。彭长连等认为抗氧化酶活性的降低是因为CO2加富降低了细胞代谢中去除活性氧的需求。CO2升高时,CAT活性降低可能是因为当Rubisco活性向羧化方向转移而H2O2的去毒需要所致。高CO2下微藻较低氧化损伤的主要原因在于加富CO2可提高pCO2/O2比率,增加CO2的同化,减少因O2作为电子受体而形成活性氧,而且CO2浓度的升高可以降低光呼吸形成的H2O2。另一方面,CO2浓度升高可能导致细胞对抗