紫贻贝中毒素成分提取及其初步鉴定

紫贻贝中毒素成分提取及其初步鉴定

近年来，随着现代分离纯度技术的快速发展，相关贝毒研究也越来越深入。关于某些类型的有毒药物和一些结构创新药物，已经发表了几篇报告。AZP(azaspiracidshellfishpoisoning)就是最近几年才从欧洲沿海国家的养殖贝类中发现的一类新贝毒。1995年11月,荷兰至少有8人因食用从爱尔兰Killary港进口的养殖紫贻贝(Mytilusedulis)而患病。1997年9～10月,爱尔兰西北部Donegal县Arranmore岛至少有12人因食用染毒的紫贻贝而患病。随后,法国、意大利和英国等也陆续报道了此类中毒事件。1996年2月,Yasumoto等从采自Killary港的紫贻贝中分离得到了azaspiracid(简称AZA1)及两种类似物AZA2和AZA3,并命名为Killarytoxin-3(KT-3)。由于AZAs(AZA1及其类似物的统称)和腹泻性贝毒(DSP)引起的人体中毒症状极其相似,一些学者最初把AZAs当作腹泻性贝毒的新成员。进一步研究发现,AZAs具有独特的化学结构和特性,与人们早已熟知的麻痹性贝毒(PSP)、腹泻性贝毒(DSP)、神经性贝毒(NSP)、记忆缺失性贝毒(ASP)和西加鱼毒(CFP)有着明显的区别,因此把由AZAs引起的人员中毒事件称为AZP。本文根据国外近年来的最新研究成果,对AZAs的化学结构、来源、地理分布、毒性效应、检测方法及作用机制等方面的研究进展作简单介绍,并对我国开展AZP研究的重点领域提出建议,以期能引起我国科学界和政府有关部门的足够重视,迅速采取行动做好防治工作,以保障水产品质量安全和消费者身体健康。1结构和性能1.1azs的结构采用高分辨率快原子轰击质谱(FAB-MS)、二维核磁共振(2D-NMR)和碰撞诱导裂解(CID)-串联质谱(MS/MS)技术测定了AZAs的结构。AZAs是一类脂溶性聚醚化合物,无色非晶质固体,其碳骨架由40个碳原子组成,分子中有20个立体异构中心和9个环(如图1)。迄今为止,研究人员已从染毒的贝类组织中分离得到了11种毒素成分(见表1)。从浮游植物细胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三种成分,推测AZA4、AZA5、AZA7、AZA8、AZA9和AZA10可能是贝类体内生物转化的产物。1.2整贝az及其类毒素的测定AZAs毒性比较稳定,常规的烹饪和加工处理无法去除,其毒性远比大田软海绵酸(OA)强,目前还没有找到有效的治疗方法和治疗药物。该类毒素有时还与OA、扇贝毒素(PTXs)和虾夷扇贝毒素(YTXs)同时存在于贝类中,易被腹泻性贝毒所掩饰,采自挪威的贻贝中曾同时检出了AZA、OA、PTXs和YTXs。为了保障消费者的健康安全,爱尔兰食品安全局(FSAI)提议,整贝AZAs的阈值浓度暂定为100×10-9,根据新的研究结果进行再修订。2002年3月,欧洲委员会规定双壳类、棘皮动物、被囊类和海洋腹足动物(全体或任何可食部分)AZAs的最大允许浓度为160×10-9。不同成分的毒性差异很大,AZA2和AZA3均比AZA1毒性强,AZA1、AZA2和AZA3对小白鼠的最小致死剂量分别为0.2×10-6、0.11×10-6和0.14×10-6。与其它聚醚类毒素主要分布于贝类消化腺中不同,AZAs遍及贝类全部组织。在染毒初期AZAs集中分布于贝类消化腺中,后期则转移到其它组织(如肌肉)中,毒性可在贝体内持续存留8个月之久,自然净化速率非常慢。不同成分分布于贝类的不同组织中,AZA1主要分布于消化腺,而AZA3则主要分布于消化腺以外的其它组织。2来源和分布2.1厚甲原多甲藻细胞中azs的表达AZAs的生物起源目前还没有明确定论。据报道,原多甲藻属(Protoperidinium)的某些种类能够产生AZAs。原多甲藻属在分类学上隶属于甲藻门(Dinophyta)、横裂甲藻纲(Dinophyceae)、多甲藻目(Peridiniales)、多甲藻科(Peridiniaceae),有记录的种类达60多种,营异养生活。从厚甲原多甲藻(P.crassipes)细胞中提取出了AZA1、AZA2和AZA3三种成分,并测得AZAs的平均含量为1.8×10-15mol/cell,其中,AZA1占总量的82%。这表明,厚甲原多甲藻可产生AZAs。其它浮游植物是否也能产生AZAs目前还不清楚,有待于进一步研究。2.2毒素类毒素检测AZAs最初从爱尔兰西海岸的紫贻贝中检出。近年来,养殖贝类染毒的区域正在逐步扩大,染毒贝类的种类也逐渐增多。在英国、挪威、法国和西班牙等国家的养殖贝类中也检出了AZAs。紫贻贝、贻贝(Mytilusgalloprovincialis)、长牡蛎[Ostrea(Crassostrea)gigas]和大扇贝(Pectenmaximus)等均检出含有该类毒素,甚至达到了较高的浓度水平。例如,在英国Craster和挪威松恩峡湾的紫贻贝肝胰腺中,毒素的总含量分别为0.24×10-6和0.82×10-6;在法国布列塔尼半岛大扇贝和西班牙加利西亚省Riadevigo海区贻贝的消化腺中,毒素的总含量分别为0.32×10-6和0.24×10-6。3毒性反应3.1细菌肠毒素安全性分析AZAs主要引起人体胃肠道紊乱,与腹泻性贝毒(DSP)和细菌性肠毒素引起的人体中毒症状极其相似。通常在进食12～24h后发作,主要表现为恶心、呕吐、严重腹泻、胃绞痛、发冷和头痛,持续时间短则1～2d,最长可达3～5d。3.2神经毒效应表现受试小白鼠不出现腹泻症状,而出现类似于麻痹性贝毒(PSP)引起的中毒症状,并表现出明显的神经毒效应。AZAs能导致多种器官损伤,小肠、胃、肺、肝、胰、胸腺和脾等为主要的靶器官,主要病理变化包括小肠粘膜层坏死、胸腺和脾的淋巴细胞坏死、肝脂肪变化、间质性肺炎和肺肿瘤等。4质谱联用技术目前,对AZP的检测方法基本上集中于小鼠生物测定法和高效液相色谱法(HPLC),尤其以高效液相色谱与质谱联用技术(HPLC-MS)的应用最为广泛。由爱尔兰食品安全促进委员会资助,爱尔兰戈尔韦海洋研究所(IMR)和英国贝尔法斯特皇后大学兽医系(VSD)共同承担的RASTA项目(2001年9月～2004年8月)试图建立一种快速、灵敏、特异的免疫学检测方法。细胞毒性试验和蛋白磷酸酶抑制试验等也正处于探索之中。4.1小鼠生物测定法小鼠生物测定法的原理是,采用适宜的化学提取方法,将样品(有毒藻类或染毒贝类)中的毒素转移到提取液中,通过向固定种系和体重的小白鼠腹腔注射提取液,记录小白鼠的存活时间以计算样品的毒素含量。小鼠生物测定法是目前最常用的贝毒分析方法,并被美国分析化学家协会(AOAC)列为PSP的常规检测方法。小鼠生物测定法具有可靠性强、使用广泛、能表达出样品中实际毒性、不需复杂设备等优点;但不够灵敏、准确性和重现性差、试验需处理大量动物、不能判定各毒素的成分、操作技巧要求较高、对试验动物的种系及体重要求苛刻。传统的小鼠生物测试法只用肝胰腺做测定,只能检测到贝类组织中AZA总量的0%～40%,因此存在较高比例的假阴性结果。4.2标准毒素l-mb法HPLC方法的原理是,利用毒素分子上的羧基与荧光物质反应,生成强荧光物质,再进行检测。HPLC法具有灵敏、准确、可靠、特异性和重现性好、能确定各种毒素成分、使用广泛、易校正、所需检测的样品量少等优点;但毒素标准品价格昂贵、样品前处理要求较高、需昂贵的设备及高素质的操作人员。液相色谱-串联质谱联用技术(LC-MSn)不需使用标准毒素,特别适用于确认毒素和鉴别新毒素。LC/MS法对AZA1的检测限为50×10-12g,灵敏度为小鼠生物测试的80000倍。Micro-LC-MS-MS法对AZA1的检测限为20×10-12g。四级杆串联质谱仪(triple-quadrupolemassspectrometer)可以检测到10-15g浓度水平。5az1对人细胞免疫组化的影响AZAs的作用机制及其在贝体内的动力学过程正处于探索阶段。Roman等研究了AZA1对人神经母细胞瘤BE(2)-M17细胞系的细胞膜电位、线粒体膜电位和F-肌动蛋白水平的影响,结果表明:AZA1对细胞膜电位没有任何改变,也不改变线粒体的活性,引起F-肌动蛋白浓度降低。Roman等采用荧光显微技术研究了AZA1对人淋巴细胞中环磷酸腺苷(cAMP)、胞液Ca2+和胞液pH值(pHi)的影响,结果发现:AZA1引起cAMP和Ca2+增加,对pHi没有影响;cAMP不受细胞外Ca2+的影响;Ca2+受细胞内钙离子库中钙的释放和通过Ni2+阻断通道从细胞外介质流入的Ca2+的共同影响,PKC的活化作用、PP1和PP2A的抑制作用以及cAMP的累积对胞液Ca2+具有负调节作用。6海洋微藻的研究建议由于我国对AZP缺乏足够的认识和了解,相关工作也还未开展,所以目前无法确定我国海域是否有产毒的原多甲藻分布,也不清楚AZAs是否影响到我国的海产品质量安全。据文献记载,原多甲藻属的一些种类在我国近岸海域分布广泛。国际现代海运事业的蓬勃发展又为广适性的海洋微藻的跨境转移创造了有利条件。因此,不能完全排除我国将来受到AZP危害的可能。为此,作者建议在我国迅速着手开展一些针对性的研究工作:(1)我国海域原多甲藻属的种类及地理分布,尤其是厚甲原多甲藻的分布区域;(2)原多甲藻的生物学和生理生态学研究,如生长特性、生活史、种群