沉淀蛋白复习过程

用于血清中药物的分析的实验前处理的有机溶剂主要是甲醇和乙腊。沉淀蛋白后再分析仍是常用的方法。通常除蛋白的方法是在含蛋白样品中加人适量的沉淀剂或变性剂，它们的作用是蛋白质脱六而沉淀如有机溶剂、中性盐有的是由于蛋白质形成不溶性盐而析出如一些酸类三氯醋酸、高氯酸、磷酸、苦味酸，以及重金属离子汞离子、铜离子，离心后取上清液用于分析。甲醇、乙睛、丙酮和乙醇是沉淀蛋白常用的有机溶剂，中性盐有硫酸铵、氯化铵等。无机盐沉淀蛋白是可逆的即将样品稀释后蛋白仍具有生理活性而有机溶剂与酸类沉淀的蛋白是不可逆的，用甲醇沉淀蛋白的优点是上清液清凉，沉淀为絮状易于分离，乙睛与之相反，产生细的蛋白沉淀。在做血浆样品时，用甲醇或乙腊沉淀蛋白，一般用血浆与沉淀剂的比例为乙腊最低1:2（一般1:3以上），甲醇最低1:3（一般1:5以上），有实验显示以血清：水：乙腊为1:2：4.5时去除效果最好。蛋白质沉淀法有：热变性及酸碱变性沉淀法用于选择性的除去某些不耐热及在一定PH值下易变性的杂蛋白。有机溶剂沉淀法多用于生物小分子、多糖及核酸产品的分离纯化，有时也用于蛋白质沉淀。等电点沉淀法用于氨基酸、蛋白质及其它两性物质的沉淀。但此法单独应用较少，多与其它方法结合使用。非离子多聚体沉淀法用于分离生物大分子。生成盐复合物沉淀用于多种化合物，特别是小分子物质的沉淀。盐析法一、盐析法一般来说，所有固体溶质都可以在溶液中加入中性盐而沉淀析出，这一过程叫盐析。在生化制备中，许多物质都可以用盐析法进行沉淀分离，如蛋白质、多肽、多糖、核酸等，其中以蛋白质沉淀最为常见，特别是在粗提阶段多用于各种蛋白质和酶的分离纯化。二、有机溶剂沉淀法有机溶剂的沉淀机理是降低水的介电常数，导致具有表面水层的生物大分子脱水，相互聚集，最后析出。该法优点在于：1）分辨能力比盐析法高，即蛋白质或其它溶剂只在一个比较窄的有机溶剂浓度下沉淀；2）沉淀不用脱盐，过滤较为容易；3）在生化制备中应用比盐析法广泛。其缺点是对具有生物活性的大分子容易引起变性失活，操作要求在低温下进行。总体来说，蛋白质和酶的有机溶剂沉淀法不如盐析法普遍。有机溶剂的选择首先是能和水混溶，使用较多的有机溶剂是乙醇、甲醇、丙酮，还有二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、乙腊和2-甲基-2,4戊二醇等。有多种因素影响有机溶剂的沉淀效果：1）温度低温可保持生物大分子活性，同时降低其溶解度，提高提取效率；2）样品浓度和PH与盐析法中的作用基本相同；3）金属离子一些多价阳离子如锌离子和钙离子在一定PH下能与呈阴离子状态的蛋白质形成复合物，这种复合物在水中或有机溶剂中的溶解度都大大下降，而且不影响蛋白质的生物活性。4）离子强度盐浓度太大或太低都对分离有不利影响，对蛋白质和多糖而言盐浓度不超过5%比较合适，使用的乙醇量不超过二倍体积为宣。三、 等电点沉淀法两性电解质分子上的净电荷为零时溶解度最低，不同的两性电解质具有不同的等电点，以此为基础可进行分离。如工业上生产胰岛素时，在粗提液中先调PH8.0去除碱性蛋白质，再调PH3.0去除酸性蛋白质。利用等电点除杂蛋白时必须了解制备物对酸碱的稳定性，不然盲目使用十分危险。不少蛋白质与金属离子结合后，等电点会发生偏移，故溶液中含有金属离子时，必须注意调整PH值。等电点法常与盐析法、有机溶剂沉淀法或其他沉淀方法联合使用，以提高其沉淀能力。四、 生成盐复合物沉淀法金属复合盐法许多有机物质包括蛋白在内，在碱性溶液中带负电荷，能与金属离子形成沉淀。根据有机物与它们之间的作用机制，可分为羧酸、胺及杂环等含氮化合物类，如铜锌镉；亲羧酸疏含氮化合物类，如概镁铅；亲硫氢基化合物类，如汞银铅。蛋白质-金属离子复合物的重要性质是它们的溶解度对溶液的介电常数非常敏感，调整水溶液的介电常数（如加入有机溶剂），即可沉淀多种蛋白。有机盐法含氮有机酸如苦味酸、苦酮酸、鞣酸等能与有机分子的碱性功能团形成复合物而沉淀析出。但此法常发生不可逆的沉淀反应，故用于制备蛋白质时，需采用较温和的条件，有时还需加入一定的稳定剂。无机复合盐法如磷钨酸盐、磷钼酸盐等。以上盐类复合物都具有很低的溶解度，极易沉淀析出。若沉淀为金属复合盐，可通以H2S使金属变成硫化物而除去，若为有机酸盐或磷钨酸盐，则加入无机酸并用乙醚萃取，把有机酸和磷钨酸等移入乙醚中除去，或用离子交换法除去。值得注意的是此类方法常使蛋白质发生不可逆沉淀，应用时必须谨慎。五、 选择性变性沉淀其原理是利用蛋白质、酶和核酸等生物大分子对某些物理或化学因素敏感性不同，有选择地使之变性沉淀，以达到分离提纯的目的。此方法可分为：1）利用表面活性剂（三氯乙酸）或有机溶剂引起变性；2）利用对热的不稳定性，加热破坏某些组分，而保存另一些组分；3）酸碱变性。六、 非离子多聚物沉淀法非离子多聚物是六十年代发展起来的一类重要沉淀剂，最早用于提纯免疫球蛋白、沉淀一些细菌和病毒，近年来逐渐广泛应用于核酸和酶的分离提纯。这类非离子多聚物包括不同分子量的聚乙二醇、NPEO、葡聚糖、右旋糖酐硫酸钠等，其中应用最多的是聚乙二醇。用非离子多聚物沉淀生物大分子和微粒，一般有两种方法：1）选用两种水溶性非离子多聚物组成液液两相体系，不等量分配，而造成分离。此方法基于不同生物分子表面结构不同，有不同分配系数。并外加离子强度、PH值和温度等影响