毒理基因组学与系统毒理学课件

2023/9/131毒理基因组学与系统毒理学

公共卫生学院预防医学系2023/7/301毒理基因组学与系统毒理学公共卫生学院预2023/9/132(一)基本概念基因（gene）,具有遗传效应的DNA片断。

基因组（genome），又称染色体组,指配子中所包含的染色体或基因的总和

一个物种单倍体的染色体数目，物种全部遗传信息的总和基因组学（genomics）：1986年提出，已经发展成为遗传学中最重要的分支学科。对物种的所有基因进行定位、作图、测序和功能分析一、概述2023/7/302(一)基本概念一、概述2023/9/133基因组学研究的最终目标获得生物体全部基因组序列鉴定所有基因的功能明确基因之间的相互作用关系阐明基因组的进化规律

2023/7/303基因组学研究的最终目标获得生物体全部基2023/9/134基因组学的研究内容结构基因组学(基因定位、基因组作图、测序)

功能基因组学又称后基因组学（postgenomics)包括：基因的识别、鉴定、克隆基因结构、功能及其相互关系基因表达调控的研究蛋白质组学:鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式2023/7/304基因组学的研究内容结构基因组学(基因定2023/9/135（二）人类基因组计划（HGP）1990，美国NIH和能源部投资＄30亿，启动了人类基因组计划，预计15年时间完成人类基因组全部序列的测定1996，完成标记密度为0.6cM的人类基因组遗传图谱，100kb的物理图谱2000，完成草图2001年2月，公布人类基因组图谱修订版2002，完成测序工作二000年六月二十六日克林顿宣布人类基因组草图绘制完成2023/7/305（二）人类基因组计划（HGP）1990，2023/9/136人类基因组草图基本信息:由31.65亿bp组成含3-3.5万基因与蛋白质合成有关的基因占2%人类基因组人类蛋白质61%与果蝇同源43%与线虫同源46%与酵母同源2023/7/306人类基因组草图基本信息:由31.65亿bCREDIT:JOESUTLIFFScience,Vol291:1221.FishinginaMoreEffectiveWay!CREDIT:JOESUTLIFFScience,V2023/9/138人类基因组计划（HGP）于2003年4月宣告结束及多种模型生物DNA序列测定的完成，生命科学研究进入了一个全新的认识领域。组学技术（-omics）引人注目，产生了基因组学、转录组学、蛋白质组学、酶组学等，其他生物分子如脂类、糖类、脂蛋白等，也将会成为组学研究的对象。

环境基因组计划（EnvironmentalGenomeProject，EGP）：加速了环境应激的基因多态性研究。

二、毒理基因组学（toxicogenomics）2023/7/308人类基因组计划（HGP）于202023/9/1391、毒理基因组学(toxicogenomics)

研究生物体的整个基因组如何对环境有害因素发生反应的一门新兴学科。研究基因组与化学毒物间的交互作用及其方式的学科。20世纪90年代后期得到不断发展，研究组织细胞特定基因的功能并预测受试物毒性。目前毒理基因组学：研究不仅包括基因组水平的效应，也包括RNA的表达（转录组学）、蛋白产物表达（蛋白质组学）、代谢组学、遗传多态性以及生物信息学等相关领域。2023/7/3091、毒理基因组学(toxicogeno2023/9/1310利用人类基因组的资料，帮助筛选和鉴别潜在的环境毒物，并在基因组水平上阐明毒作用发生的机制。近期目标：是确定某种有害因素的反应基因（信号基因）用于毒理学和相关疾病的研究。

远期目标：建立全基因组与蛋白质组毒性反应知识库，并在此基础上开辟以芯片技术和生物信息技术为特征的数字毒理学（digitizedtoxicology）。§2毒理基因组学基本任务、研究目标2023/7/3010利用人类基因组的资料，帮助2023/9/1311

毒理基因组学为从传统的遗传毒性检测方法到基因集群检测方法的转变提供了可能，同时将显著提高遗传损伤的检测水平和降低检测的阈值。如微阵列技术的应用等，理论上该项技术有可能检测一种特定的化学物对全部人类基因组的效应。突破了传统毒理学实验中“一个化学物，一个基因”的方法，提高了效率。2023/7/3011毒理基因组学为从传统2023/9/1312

美国环境卫生科学研究所（NIEHS）于2000年成立国家毒物基因组学中心（NCT）。主要目标：①促进基因和蛋白质表达技术的应用；②阐明环境暴露与人类疾病易感性间的关系；③识别疾病相关的和毒物暴露的生物学标志；④改进定量方法以阐明暴露水平和暴露—反应间的生物学因果关系；⑤建立毒物在生物系统中环境效应的公共数据库。2023/7/3012美国环境卫生科学2023/9/13132023/7/30132023/9/1314毒理基因组学为毒性或致癌性评价发展新的、可提供更多信息的试验系统。为对药物或其它外源化学物的易感性或反应差异阐明遗传学基础。发展生物学标志用于暴露定量。4阐明疾病或毒效应的机制和途径。发展用于人群研究的工具和资源。

OldenK,20022023/7/3014毒理基因组学为毒性或致癌性评价发展新的2023/9/1315毒理基因组学面临的基本挑战：一是如何获取大规模的生物学数据（基因组、转录组、蛋白质组和代谢组的表达数据）：高通量筛选系统提供了可能。二是如何对高通量筛选所得到的大量信息进行及时而合理的处理。如：既有基因表达的数据，还有经典毒理学的试验资料等

第二节毒理基因组学研究的技术平台2023/7/3015毒理基因组学面临的基本挑战：第二节2023/9/1316美国国家毒物基因组学中心（NCT）研究策略↓↓cDNA→异常值→关系→Northern微阵列分析§分析RT-PCR

证实毒物基因组学分析功能分析↓↓化学物特异性暴露蛋白质组（时间/剂量）谱组织表达↓↓组织表达结合原位细胞蛋白质组分析表达└────┬────┘进入数据库2023/7/3016美国国家毒物基因组学中心（NCT）研究2023/9/1317一、基因组学与转录组学技术平台（一）差异显示反转录PCR技术（DDRT-PCR)

以PCR和聚丙烯酰胺凝胶电泳为基础。PCR技术的原理：以DNA的一条链为模板，在有RNA引物、4种脱氧核苷酸（dNTP）时，和DNA聚合酶的条件下，在引物所结合的位置向3’方向合成新的互补链。其反应以双链DNA的变性、退火、延伸为一个循环。经过多次循环（25~30次），便目标DNA片段得以大量扩增。由于每一次循环所产生的新链均可成为新的模板用于下一轮循环，故PCR产物以指数方式增加。2023/7/3017一、基因组学与转录组学技术平台（一）差2023/9/1318PCR步骤：（1）高温变性，双链DNA变性（90～95℃）成为单链DNA；（2）低温退火（37-60℃），引物与单链DNA互补序列结合；（3）适温延伸，DNA聚合酶催化（70-75℃）使引物延伸。

2023/7/3018PCR步骤：（1）高温变性，双链DNA2023/9/1319温度（℃）时间（min）94726094℃变性（1min）60℃退火（1min）72℃延伸（1.5min）循环1循环2循环3PCR反应的温度循环周期PCR反应的每一个温度循环周期都是由DNA变性、引物退火和反应延伸三个步骤完成的。图中设定的反应参数是94℃变性1min，60℃退火1min，72℃延伸1.5min。如此周而复始，重复进行，直至扩增产物的数量满足实验需求为止。2023/7/3019温度（℃）时间（min）9494℃变性2023/9/1320差异显示反转录PCR（

DDRT-PCR）原理：

用3’-端锚定引物和反转录酶合成cDNA的第一链；用3’-端锚定引物和5’-端10-mer随机引物组成引物对，以反转录第一链为模板进行PCR扩增（DDRT-PCR），在标准的序列胶中电泳2~3小时，可显示出50~100条长度在100~5000bp之间的DNA条带。2023/7/3020差异显示反转录PCR（DDRT-PC2023/9/1321基本过程：1.从一对处于不同发育阶段（或不同基因型）的细胞群体中分离总mRNA，并用3’-端锚定引物作反转录合成第一链cDNA;2.用5’-端随机引物和3’-端锚定引物组成的引物对，在加入放射性同位素标记的dNTP的条件下，以第一步反转录产物作模板进行PCR扩增。3.将扩增样品在变性的DNA测序胶中进行电泳分离；2023/7/3021基本过程：2023/9/13224.将有关的差别表达的DNA条带从测序胶上切割下来回收其DNA片断；5.胶块中的DNA量非常少，不能用于克隆，需进行二次扩增；6.将克隆的特定的DNA分别同基因组DNA及总mRNA作Southern或Northern杂交，测序；7.以此目的片断作探针从cDNA文库中或基因组文库中筛选全长的cDNA克隆或基因组克隆。2023/7/30224.将有关的差别表达的DNA条带从测序2023/9/1323优点：

1.可以同时比较多个样品表达的差异；

2.可以同时检测“上游”及“下游”的基因；

3.检测灵敏度高，所需样品少，经PCR扩增一些低峰度的mRNA也可以被检测出来；

4.结合使用了PCR和序列胶电泳分析两项技术，使本方法显得较单方便。2023/7/3023优点：2023/9/1324局限性：

1.假阳性比例高（50%～75%）；

同一长度的条带，含有多种DNA序列；邻近条带回收时，造成人为误差；

mRNA3’-端序列保守性高，而常用3’-端cDNA作探针。

2.扩增的差别条带分子长度比较短小（110～450bp）；

2023/7/3024局限性：2023/9/1325（二）基因表达序列分析（serialanalysisofgeneexpression,SAGE）

SAGE的主要理论依据：来自cDNA3’端特定位置的一端9-11bp长的序列能够区分基因组中95%的基因。这一段基因特异的序列被称为标签（SAGtag）2023/7/3025（二）基因表达序列分析（serial2023/9/1326SAGE的原理：一是一个9-10个碱基的短核苷酸序列标签包含有足够的信息，能够唯一确认一种转录物。例如，一个9个碱基序列能够分辨262144个不同的转录物（49），而人类基因组估计仅能编码80000种转录物，所以理论上每一个9个碱基标签能够代表一种转录物的特征序列。二是如果能将9个碱基的标签集中于一个克隆中进行测序，并将得到的短序列核苷酸序列以连续的数据形式输入计算机中进行处理，就能对数以千计的mRNA转录物进行分析。2023/7/3026SAGE的原理：2023/9/1327用cDNA制备SAGE标签----将标签串联-----再进行测定：可以显示SAGE所代表的基因在特定组织中是否表达，根据各SAGE标签所出现的频率可作为其所代表的基因表达丰度。2023/7/3027用cDNA制备SAGE标签----将标2023/9/1328但是SAGE只能分离特定时空下表达的基因，且不能分析基因内和基因间的调控序列，克隆出的新基因的功能也有待鉴定。1.SAGE能快速全范围提取细胞内基因表达信息，并对已知基因进行量化分析。2.能分离克隆新基因。3.定量比较不同状态下的组织细胞特异基因的表达。4.构建染色体表达图谱。2023/7/3028但是SAGE只能分离特定2023/9/1329

应用SAGE技术的一个前提条件是GenBank中必须有足够的某一物种的DNA序列信息，尤其是表达序列标签的序列资料。2023/7/3029应用SAGE技术的一个2023/9/1330微阵列技术（microarrytechnology）一种研究有多少基因能相互作用以及一个细胞网如何同时控制大量基因的新方法。利用机械手精确地将大量DNA分别点到载玻片上。研究者然后从他们研究的细胞中提取的DNA标上荧光标记。标记探针能与载玻片上的DNA互补连接。将载玻片放入扫描仪下，测量每个荧光点的亮度，亮度反映了特定DNA片段存在的量。（三）微阵列分析2023/7/3030微阵列技术（microarrytec2023/9/1331生物芯片的概念：是指能够快速并行处理多个样品并对其所包含的各种生物信息进行解剖的微型器件，它的加工运用了微电子工业和微机电系统加工中所采用的一些方法，只是由于其所处理和分析的对象是生物样品，所以叫生物芯片(Biochip)。

高通量，平行化，微量化的分析手段。

人类和小鼠的全基因组芯片。2023/7/3031生物芯片的概念：是指能够快速并行处理2023/9/1332生物芯片的分类基因芯片

cDNA芯片Oligo芯片

信息生物芯片

蛋白芯片

生物芯片

微流体芯片功能生物芯片

芯片实验室

组织芯片（微阵列芯片）（微流控芯片）2023/7/3032生物芯片的分类基因芯片2023/9/1333DNA微阵列（microarryassay）或DNA芯片（DNAchip）技术是新近发展的分子生物学研究工具。基本硬件：基因微阵列或基因芯片，其上含有成千上万个寡聚核甘酸片段或cDNA探针（cDNA、EST或基因特异的寡核甘酸）。将探针按一定顺序以矩阵方式排列在载玻片大小的塑料或玻璃板上。2023/7/3033DNA微阵列（microarryas2023/9/1334通常采用发红色荧光的Cy3和发绿色荧光的Cy5荧光色素，分别标记实验和对照样品中的RNAs.荧光强度和RNAs的含量间有一定关系，通过两种荧光的相对强度变化来确定实验组样品中DNA表达的差异。如：样品中RNA多于对照样品时，荧光呈红色，反之为绿色。

两样品RNA含量相等时，呈黄色荧光。如能结合实时PCR，就可得基因的定量表达信息。

DNA微阵列分析灵敏度高，成本也高2023/7/3034通常采用发红色荧光的Cy3和发绿色荧光2023/9/1335cDNAclones(target)PCRproductamplificationpurificationprintingmicroarrayHybridisetargettomicroarraymRNAprobe)excitationlaser1laser2emissionscanninganalysisoverlayimagesandnormalise0.1nl/spot2023/7/3035cDNAclonesPCRprod2023/9/1336(四)RNA干涉（RNAinterference，RNAi）技术RNAi是一种基因功能研究的新方法，能快速有效地沉默靶基因的表达，从反向角度阐明基因的功能。是指将外源性双链RNA(doublestrandedRNA,dsRNA)导入细胞后，产生21-23nt长度的小分子干涉RNA，引起与其序列同源的特异基因mRNA降解的现象，属于转录后的基因沉默。2023/7/3036(四)RNA干涉（RNAinte2023/9/1337四个重要特征:1)RNAi属于转录后水平的基因沉默机制;2)具有高度的序列特异性;3)具有抑制基因表达的高效性,可以引起该基因缺失突变的表型;而且远远少于内源mRNA数量的dsRNA就可以实现完全的抑制效应,即其发生过程中存在着正反馈的信号放大效应;4)RNAi的效应可以在不同细胞间长距离传递和维持,而且在某些生物中(比如线虫)具有遗传性。2023/7/3037四个重要特征:2023/9/1338RNAi技术主要包括siRNA的设计、合成、向细胞内的导入和沉默效果的检测四个步骤。

RNAi实验的五个步骤：1）选取目的基因2）设计相应的siRNA序列3）制备siRNA：化学合成法、体外转录合成法、鸡尾酒法4）siRNA转染哺乳动物细胞：脂质体转染、微注射或电穿孔法5）RNAi效果分析：可从mRNA和蛋白质两个水平评价2023/7/3038RNAi技术主要包括siRNA的设计、2023/9/1339基因功能研究：通过RNAi特异性抑制基因的表达来阐明基因在生物体中的特定功能。基因治疗：利用RNAi技术还可以抑制病毒在感染细胞中的复制增殖，达到治疗病毒相关疾病的功效。目前已在病毒性肝炎病毒、HIV等病毒的RNA干涉治疗尝试取得了良好效果。癌症治疗：RNAi技术还给癌症治疗带来了希望。RNAi技术也适用于基因异常表达导致的遗传病以及其它疾病的基因治疗RNAi技术的应用：2023/7/3039基因功能研究：通过RNAi特异性抑制2023/9/1340（五）单核苷酸多态性检测（SNPs）单核苷酸多态性：是指染色体基因组水平上单个核苷酸变异引起的DNA序列多态性，人群中发生频率大于1%。有单碱基的转换、颠换、插入、缺失等形式。25%发生于GpG位点，发生C-T转换。SNP：是由于单个核苷酸改变而导致的核酸序列多态。2023/7/3040（五）单核苷酸多态性检测（SNPs）2023/9/1341

人类99．9％的基因密码是相同的，而差异不到0．1％，不同人群仅有140万个核苷酸差异。这些差异是由“单一核苷酸多样性”（SNP）产生的，它构成了不同个体的遗传基础。在整个基因组序列中，人与人之间的变异仅为万分之一，从而说明人类不同“种属”之间并没有本质上的区别。

2023/7/3041人类99．9％的基因密码是相同2023/9/1342蛋白质组与基因组相比蛋白质组具有多样性和可变性。对一个机体而言,基因的数目是恒定的,而蛋白质的种类和数目在同一个机体的不同细胞中各不相同,即使同一细胞在不同的时期（不同的分化程度或不同细胞周期）,不同条件（不同的外源性或内源性刺激）下,其蛋白质表达也不同。虽然可以通过cDNA芯片等方法显示生物体的基因启动状况,但mRNA水平(包括mRNA的种类和含量)并不能完全反映出蛋白质的表达。2023/7/3042蛋白质组与基因组相比蛋白质组具有多样性2023/9/1343二、蛋白质组学（proteomics）技术平台鉴定蛋白质的产生过程、结构、功能和相互作用方式目前常用技术路线是利用双向凝胶电泳分离蛋白、综合质谱和生物信息学分析技术进行鉴定。目前蛋白质组学研究的核心技术是：双向凝胶电泳和质谱技术2023/7/3043二、蛋白质组学（proteomics）2023/9/1344（一）双向凝胶电泳（2-dimensionalgelelectrophoresis,2-DE）原理：细胞抽提物在电泳过程中，依据蛋白质所带电荷及分子大小而被分离。样本制备的基本目的：尽可能使样品转变为适合进行等电聚焦的状态，同时保持原有的电荷和等电点。电泳时，使用窄pH及极窄pH范围梯度凝胶可提高2-DE的分辨率，尤其适用于低丰度蛋白的检测。还可采用胶上差示电泳（DIGE）。2023/7/3044（一）双向凝胶电泳（2-dimensi2023/9/13452D-蛋白质电泳2023/7/30452D-2023/9/1346蛋白质组学研究步骤2023/7/3046蛋白质组学2023/9/1347二维凝胶电泳分离蛋白质的方法具有一定局限性：①所得的结果在蛋白质的实际身份和起源基因或基因之间不能建立联系。②对于一些表达量低,但在细胞中起重要作用的蛋白,以及溶解度极大,极小或极端的蛋白PI值,不能很好的分离。③分离的蛋白点不一定只代表一种蛋白质。据报道,通过此方法分离的真核组织的蛋白点有20%～40%的点包括了至少两种或两种以上的蛋白质。蛋白质富集的变化与mRNA的变化间只有中等程度的相关性(r=0.61),而且蛋白质磷酸化与mRNA也没有特定关系。因此在功能基因组学研究中，mRNA微阵列和二维凝胶电泳/质谱技术是相互补充的。

2023/7/3047二维凝胶电泳分离蛋白质的方法具有一定局2023/9/1348代谢组学MetabonomicsNicholsonJK等（1999）提出代谢组学概念。以NMR技术分析体液中代谢物的“整体模式/指纹”，可以无损伤地观察动物的生理生化状态，动态评价药物毒性效应。与毒物基因组学/蛋白组学技术相结合，代谢组学可以从基因型到表型完整地评价药物的毒性。NicholsonJK，etal.Xenobiotic1999,29(11):1181-11892023/7/3048代谢组学MetabonomicsNic2023/9/1349代谢组学技术平台（一）磁共振（NMR）可在一次单独的检测中获得生物体液中成百上千的代谢物组分的信息，不需预先确定被检测物质的性质。所需样品量较少、不需复杂的样品处理或衍生措施，且样品还可回收用于其它分析。

NMR可分为氢谱（HNMR）和碳谱（CNMR）(二)色谱-质谱联用技术气相色谱、高效液相色谱和质谱及其联用技术因分离特性和灵敏度较好，已在代谢组学研究中广泛应用。毛细管电泳（CE）和质谱联用是代谢组学分析的新方向。2023/7/3049代谢组学技术平台（一）磁共振（NMR）2023/9/1350第三节毒理基因组学研究内容及其应用一）毒作用机制研究二）化学物毒性预测三）比较毒理学研究四）混合物联合毒作用研究五）危险度评定六）表型锚定七）信息整合2023/7/3050第三节毒理基因组学研究内容及其应用2023/9/1351表型锚定毒理基因组学的一个主要内容，是将特定的基因图谱改变与特定剂量或时间条件下的毒性损害相联系的过程。2023/7/3051表型锚定毒理基因组学的一个主要内容，是2023/9/1352毒物基因组学将促进：

机制毒