微藻种群动力学过程中病毒的作用

微藻种群动力学过程中病毒的作用

海洋生态系统微生物在物质循环和能量流动过程中的重要作用一直是海洋生态的热点。高丰度病毒的发现（通常为106109mm）引起了人们的注意。海洋病毒是全球生物地化循环的驱动者和海洋环境中最大的生物多样性库,而藻类病毒在全球气候变暖过程中以及海洋生态系统微食物环调节中起着十分重要的作用。尤其是病毒作为一种导致微藻自然死亡率介质的潜在意义受到极大关注。自然水域中,浮游植物的损失主要源于浮游动物的捕食、细胞下沉和自然裂解3个方面。人们传统上认为,浮游动物的捕食及细胞下沉作用是微藻细胞损失的主要因素,浮游动物的种类及其选择性捕食机制的多样性影响着微藻种群的演替过程。近些年,微藻的自然死亡(即细胞自然裂解,主要包括:由于病毒感染导致的细胞大量裂解以及由于细胞衰老引起的细胞裂解)率已被公认是导致微藻损失的更为重要的因素。藻类细胞裂解可以用于解释野外现场实验研究中非捕食、非下沉的损失。同时,病毒(或病毒类似颗粒)已在一些真核微藻的主要类群中被发现,其中包括微微藻、超微藻和微藻、游动与非游动种类、包含有害赤潮藻(HAB)在内的赤潮形成种以及自由生活的、和共生的生物。病毒感染微藻通常是宿主特异性的,有时甚至只专一地感染1个宿主株系。病毒通过裂解宿主细胞间接影响能量、营养和有机质的流通过程,尤其是在生物量巨大的赤潮暴发期。越来越多的证据表明,病毒可以通过减少宿主种群数量或防止藻类宿主种群数量达到高峰的方式控制微藻动力学指标。同时,藻类病毒宿主范围的高度特异性特征的确定改变着我们对微藻种群动力学过程的认识。由病毒介导的宿主死亡可能不仅会影响藻类物种的种间演替,也可能会影响种内演替。近期除了2篇强调蓝藻噬菌体的综述外,有关真核藻类病毒的综述大都集中在初步阐述病毒的生物学方面。近年,国内学者也陆续报道了有关藻类病毒研究的一些综述,集中在病毒对赤潮调节的应用潜力上。目前,已分离出多种赤潮藻病毒,藻类特异病毒与宿主稳定感染模型体系的建立为深入研究病毒与宿主之间相互作用机制提供了方便。大量的证据显示,病毒很可能是引起微藻死亡的主要机制之一。病毒似乎是生物多样性的重要调控者和再生食物链的重要驱动者。由于微藻赤潮的消亡有赖于病毒感染,因而使藻类病毒在海洋系统中的重要作用尤为突出。1藻类dna病毒的鉴定微藻类病毒广泛分布于自然界,可分布在富营养型到寡营养型的生态系中,甚至存在于沉积物中。首批被分离出的藻类病毒是从绿藻类似种-绿草履虫(Parameciumbursaria)中分离出来的(PBCV-1),并对该病毒进行了详细研究。该病毒的特征不同于其他已知病毒,它构成了1个新的病毒家族,即藻类DNA病毒科。迄今,多数病毒-藻类培养系统属于(或类似于)特异性感染真核藻类(淡水、海水皆可,微藻和大型藻类)的藻类DNA病毒家族。藻类DNA病毒科的病毒都是多面体、无胞膜和明显的尾部、直径在100～220nm之间,大都含有100～560kbp大小的双链DNA基因组。目前已在实验室成功建立了几十种病毒-宿主稳定感染系统模型,并对培养的感染真核微藻的病毒特征进行了比较研究。结果发现病毒颗粒、基因组和裂解量(每个宿主细胞裂解释放出的子代病毒数量)千变万化,藻类DNA病毒的潜伏期往往比藻类宿主细胞的最低倍增时间要长,大约是在3～48h之间。近年也陆续报道了一些RNA病毒感染单细胞藻类。2株毒性有害赤潮异弯藻(Heterosigmaakashiwo)(Raphidophyceae)和圆鳞异囊藻(Heterocapsacircularisquama)(Dinophyceae)能被单链RNA病毒感染。而且发现这些较小的单链RNA病毒粒子(直径<30nm)对宿主细胞的裂解率比较高。这些科目的藻类是否对单链RNA病毒感染比较敏感尚无定论。另一类型的RNA病毒可以感染绿色鞭毛藻Micromonaspusilla,该藻是1种全球性分布的种类,其细胞密度可高达104/mL,但不是赤潮形成种。藻类病毒基因组的大小差异极大(从4.4～560kbp之间),就单链RNA病毒的基因组而言相对较小,大约在3～12kbp之间(如感染H.circularisquama和H.akashiwo的单链RNA病毒基因组分别为4.4和9.1kbp);而感染刺球金色藻(Chrysochromulinaericina)和1种塔胞藻(Pyramimonasorientalis)的双链DNA病毒的基因组则非常大(分别为510和560kbp)。令人惊叹的是已知的最小的有生命的微生物-生殖支原体(Mycoplasmagenitalium)的基因组(580kbp)只比感染上述塔胞藻的病毒基因组大20kbp。另外,有趣的是某些微藻种类(尤其是甲藻类)可能被1种以上类型的病毒感染,已在同一种H.circularisquama细胞中同时分离出1种DNA病毒和1种RNA病毒。目前,对这一系统的生物学特征了解很少。有关海洋甲藻病毒的研究,Nagaski等最近发表了1篇较为详细的综述。从培养的微藻种类看,P.orientalis、球石藻(Emilianiahuxleyi)和H.akashiwo的细胞中可以携带多种不同大小级别的病毒。了解在何时、何种情形之下特定病毒会不会感染藻类宿主具有重要的生态学意义,也是决定自然条件下感染成功与否的关键。目前已建立的病毒-藻类稳定感染模型系统中使用的藻类大多都是赤潮藻种,而且近一半被认定是有害赤潮种。由于典型的微藻赤潮往往是发生在富营养水域,因而大多数藻类病毒都是从沿岸海域中分离出来的。稳定的病毒-藻类模型系统可在高度控制的条件下深入研究病毒与宿主之间相互作用关系,对于进一步研究赤潮动力学以及病毒感染导致宿主细胞裂解和死亡的机制等有着重要意义。2藻类病毒与主要症状之间的微生态平衡2.1病毒对微藻赤潮的影响使种群密度保持恒定的过程称之为自然控制。这种调节微藻种群的主要因素就是病毒的感染。从实验室研究中得知,病毒的裂解可能导致微藻种群的死亡和数量减少。但是,病毒控制自然界微藻种群的程度如何,尚待进一步研究。Brussaard就微藻种群控制提出了2种假设模型即“控制”和“预防”,在种群“控制”中最常提及的就是宿主种群在密度上的减少(也是最简单的1种控制方式)。该模型中对于那些种群密度已达高峰并具有潜在的崩溃危机的宿主种群进行加速降低(见图1A),通过减少高丰度的宿主数量,有赖于加速减少原本就是高丰度的、并且有密度潜在危险的宿主种群,已确认病毒是微藻赤潮消亡的1个主要因素。在“预防”模型中,预防性病毒控制过程是限制种群的增长,即通过限制尚处于低丰度的藻类种群数量的增加来控制宿主种群密度(见图1B)。一些研究显示,病毒可以限制宿主种群的规模,从而防止赤潮的暴发。但是,自然界中微藻的赤潮情况仍频频发生,这表明病毒并不总是能够有效地控制宿主细胞的数量。细胞密度是病毒控制微藻种群的重要调节指标。病毒依靠扩散去接触宿主细胞,并且接触率直接受限于病毒和宿主的丰度。而病毒对宿主种群感染的增加很可能是因为宿主种群的丰度有所增加。2.2保肝作用检测微藻死亡率由于缺乏用于病毒诱导的宿主死亡率测定的可靠方法,有关自然水域中病毒对微藻裂解率的报道很少。同时,对自然界微藻细胞总裂解率的估计也存在较大的时空差异,如每天高达0.3%的浮游植物死亡率(此处主要指由病毒裂解导致的浮游植物细胞死亡占种群的比例)情况不仅出现在藻类赤潮暴发后的消亡阶段,也出现在寡营养的生态系统中。对P.globosa赤潮动力学的围隔实验生态系研究发现,在赤潮消亡期,感染的球型棕囊藻系统中,病毒的数量随着宿主细胞总裂解率的增加而显著增加。1个精确的生态系统模型表明,病毒会造成大多数藻类的裂解。目前已建立了几种方法用于估计病毒介导的微藻死亡率。以被感染细胞出现的频率为基础评估病毒介导的死亡率,这种方法最直接而且不需要对样品进行培养。现场E.huxleyi赤潮追踪研究表明,在赤潮消亡过程中,50%以上的藻类细胞被病毒感染。透射电镜观察被感染的细胞,并通过校正病毒裂解周期的比例来计算被病毒感染的细胞的数量。使用透射电镜观察方法对蓝细菌的研究结果显示,蓝细菌中总死亡率的6%～24%是由于病毒感染引起的。另外1种方法是通过病毒总量和每个细胞释放的病毒粒子数来计算细胞的裂解率。在室外大型围隔E.huxleyi赤潮诱导实验过程中发现,由病毒诱导的死亡率可占细胞总的净死亡率的12%～100%。使用这种方法估计微藻死亡率的假设前提是病毒粒子的释放量是已知的,而且可以将感兴趣的病毒与样品中其它病毒区分开来。环境样品中很多微藻病毒具有较强的绿色荧光或对核酸敏感染料产生的散射信号,因此可以利用流式细胞仪将它们从总的病毒中区分开来。目前就病毒感染导致微藻死亡率的各种计算方法都存在不同程度的缺陷,如以被感染细胞出现的频率为基础评估病毒介导的死亡率,这种方法最直接而且不需要对样品进行培养,但电镜的制样和观察过程仍比较烦琐。为此,作者实验室通过克隆和表达藻类特异病毒外壳蛋白(见图2)并免疫产生特异性抗体,在此基础上通过免疫荧光分析技术以达到精确分析和监控被特异病毒感染和裂解的微藻占种群的比例。显然,自然界病毒介导的微藻死亡率很高。对蓝藻噬菌体(也称噬蓝细菌体)和1种绿色鞭毛藻(M.pusilla)病毒的研究表明,病毒与宿主之间能够稳定共存,并且病毒的丰度变化也比较慢。而感染赤潮藻(如E.huxleyi)的病毒与其宿主藻之间存在非常明显的动力学关系,同时病毒导致的宿主死亡率高低变化很大。2.3球石藻病毒的浓度和人的毒性感染依赖于病毒与宿主之间的随机相遇,因此,宿主细胞的颗粒大小和运动性是很重要的特性。通常,在病毒浓度一定的情况下,其更容易抵达体积较大的宿主细胞表面。但是,由于海洋中小颗粒宿主的高丰度,使得任何病毒都有更多的机会接触小颗粒表面(赤潮条件下,由于宿主细胞的密度相对较高,因此可以看成是个例外)。宿主细胞的运动(如游泳)提高了传递率。因此,理论上讲,较大的不游动的微藻种类相对于较小的、游动自如的种类,其感染率较低。但较大的藻类宿主释放的病毒粒子相对较大,这就使得这种由宿主个体大小带来的感染差异性在某种程度有所抵消。除了个体大小,宿主细胞的其他形态特征也影响病毒的感染率。现场E.huxleyi赤潮的研究显示,具鞭毛的细胞比具球石的细胞更容易被病毒感染。而且,处于稳定生长期并脱去球石的藻细胞,在赤潮消亡过程中,被病毒感染的细胞比例明显增大。同样,在室外围隔实验中,当具有高的侧向角散射的具球石的细胞转变成具有低侧向散射的无球石细胞时,体系中球石藻病毒的浓度将增高。使用活性染料钙黄绿素-AM显示:对于具有低散射的E.huxleyi种群,其绿色荧光降低了8倍,这说明,随着病毒浓度的增加,宿主细胞出现死亡。是否形态变化确实诱导病毒感染(即不形成球石阶段更容易被感染)还需进一步详细研究。另外,微藻溶解性有机物的释放可以作为1种间接防御物质通过支持细菌生长以抵抗病毒的感染。当藻类种群在加入病毒前先与不含病毒的裂解液培育10min后,细胞裂解率及裂解程度均有所降低。因此,裂解的细胞(除了释放出的子代病毒)可能会释放出1种抑制剂,能减少病毒对种群中其它个体的感染。也有报道病毒感染H.akashiwo导致了被感染的宿主细胞下沉率增大,从而迅速消除了真光层中被感染的细胞的数量,保护种群中其他细胞免受感染。在高等动植物中,病毒感染影响宿主细胞的一系列生化代谢过程而导致细胞凋亡(或程序性细胞死亡)。最近发现,病毒感染微藻也可能诱导宿主细胞的凋亡,如在感染的赤潮异弯藻细胞中检测到了细胞凋亡的特征,单链RNA病毒感染的赤潮异弯藻细胞中发现在核区外围的异染色质化(此时没有可见的病毒小颗粒)。Bidle等人最近在病毒感染的E.huxleyi细胞中检测到凋亡关键蛋白metacaspase的表达,同时伴随着光合作用效率(Fv/Fm)显著降低。作者实验室最近就室内纯培养的病毒-宿主稳定感染系统研究了病毒感染海洋E.huxleyi和C.ericina及其对宿主细胞的裂解情况,发现在病毒感染后的48h内均可以明显导致宿主细胞裂解和死亡(见图3),但死亡的途径似乎不同,前者病毒感染后诱导了宿主细胞出现明显的凋亡形态学和生物化学特征,而后者则似乎没有出现明显的细胞凋亡现象。这一结果初步显示,海洋藻类病毒感染宿主细胞后可能部分通过诱导宿主细胞凋亡程序以控制宿主的种群密度。C.ericina被认为是非赤潮种,病毒感染导致的这种特殊变化是否有利于病毒的复制,但不刺激细胞进入加速分裂,因而也不导致赤潮发生?从这一点看,赤潮和非赤潮藻对病毒感染的不同响应将具有极其重要的生态学意义。尽管细胞最终是死亡了,但凋亡可能仍是1种非常有效的种群防御机制,因为感染的个体阻止了新的病毒后代的形成,因此直接保护了未感染的细胞免受病毒的寝染。对病毒感染的防御最终导致宿主抵抗病毒的浸染。实验室对噬菌体-细菌宿主系统模型的研究中显示,噬菌体要靠降低生长能力和竞争能力来抵制宿主。究竟哪些因素影响和调控微藻细胞对病毒感染的抵抗性至今仍是个未知数。2.4病毒对宿主细胞的作用将浓缩的病毒(自然海水经超滤)添加到野外现场试验样品中人为地提高病毒的浓度,随着病毒浓度的增高,宿主光合作用率明显降低,表明病毒感染的密度依赖关系。对某一种特定的微藻种类而言,在规定的时间内病毒的感染率可能非常小而无能阻止宿主细胞的累积;但随着宿主细胞浓度的增高,感染率也有潜在增加的可能性。最终,由于超过宿主细胞丰度的阈值,使感染迅速蔓延,继而赤潮迅速消亡。微藻的细胞是单细胞这一事实,意味着被裂解性病毒感染后将不可避免地导致细胞死亡,并迅速影响到种群的丰度。培养的病毒-藻类系统表明,病毒诱导的藻类宿主细胞裂解通常发生在感染后的1～2d并可以明显检测到病毒感染对宿主细胞DNA合成的影响。病毒感染P.pouchetii和M.pusill后的几个小时内,小于藻类基因组的那部分细胞颗粒伴随着第一个裂解信号的产生而开始增加,用流式细胞仪可以明显检测到被病毒感染的藻类宿主细胞中有与对照组截然不同的光散射及叶绿素自发荧光。对不同种藻类来说,病毒感染后细胞的体积(前向角散射)及其内部结构和形态(侧向角散射)都不尽相同。可见,病毒的感染影响到那些依靠光合作用供能的宿主细胞的光合作用速率。有时病毒感染后迅速抑制宿主细胞CO2的固定和光合作用活性;而有时光合作用则是逐渐减小,或继续缓慢地进入裂解周期。用最大光量子产量(Fv/Fm)作为光合作用能力评价指标,感染的M.pusilla细胞经过潜伏期后就失去了光合能力。近年发展起来的流式细胞变量分析微藻的方法为测定活性细胞、死亡细胞以及估计病毒诱导的藻类死亡率提供了手段。只能透过受损细胞细胞膜的敏感核酸分子染料(如SYTOXGreen,MolecularProbesInc.,Leiden,TheNetherlands)被用于定量“死亡的细胞”。感染培养中死亡细胞百分比的增加非常迅速,对该系统的研究推断死亡率分别为0.3～0.8/d。可见,病毒能够通过感染微藻种群进而降低宿主细胞丰度来对微藻种群结构产生重大的影响。由于病毒通常具有种类限制性的宿主范围,被特定的藻类病毒感染并不能影响到整个微藻的群落,而只是在特定的种群水平上进行调节。病毒裂解迅速导致病毒和藻类宿主群落结构的动力学变化,从而控制微藻的多样性。因此,病毒在调节种间竞争和演替中具有重要的生态学作用。目前人们逐渐认识到,一种微藻物种特定的地理种群在形态学和遗传学上不是同源的,而是表现出多样性特征。病毒除了在种间水平上控制微藻多样性,也可能在种内水平上影响微藻的多样性。就宿主对病毒感染的特异性和敏感性而言,最基本的因素是表型的多样性。已发现来源于同一地理位置的不同病毒株可以共存-即不同病毒可以存在于同一宿主种群,如从某一沿岸海域的水样中分离出了能够感染并导致M.pusilla裂解的3株病毒克隆,其形态特征都类似与已报道的能特异感染M.pusilla的病毒(MPV),但对其基因组的限制性酶切片段分析发现,这些病毒在遗传学上却完全不同。对病毒感染的免疫多样性(或宿主特异性)特点具有1个潜在的优势,即细胞裂解可为同一宿主种类未被感染的藻系提供可利用的营养。假如在不同的藻系之间存在着竞争,那么优势种中只有特殊藻系的细胞数量会有所减少而不会涉及到种类细胞总丰度的变化,即使有影响也是暂时的。当对病毒感染的敏感性体现在藻系水平上时,这种敏感性可能成为微藻的一种优势。如,就病毒感染与H.akashiwo的赤潮动力学建立了1种概念性模型,该模型反映了藻类亚种种群的演替与宿主种系特异性病毒感染之间的相应关系。因此,除了定量控制,病毒还通过维持种类遗传和生理的多样性对微藻产生定性影响。问题的关键是:决定宿主特异性的重要因素是什么?就种系特异性而言,多种不同病毒如何共存于同一种群的宿主细胞中?分子生物学技术对于区别感染同种藻的不同病毒非常有用。Cottrell和Suttle利用DNA杂交技术成功地检测出感染M.pusilla的病毒的遗传相似度。Chen和Suttle利用DNA聚合酶基因片段的核酸序列确定了从M.pusilla分离出的8种病毒的遗传学差异。病毒外壳蛋白基因g20已被成功地用于揭示蓝藻噬菌体克隆多样性的变化。最近,真核藻类病毒主要外壳蛋白基因扩增片段已被成功用于真核藻类双链DNA病毒家族的系统发生学研究。3synechococcusspp.7细胞表型的变化环境因素(如温度、光照等)和营养条件的变化是引起浮游植物物种演替的主要原因。为了充分了解病毒与微藻种群之间的相互作用,就必须查明影响病毒感染和复制的因素。由于病毒的复制依赖于宿主的代谢,因此影响宿主生理状态的环境因素也会影响病毒。研究表明,光、温度以及营养限制会对病毒的动力学造成影响。感染绿藻Chlorella的病毒不依赖于宿主的光合作用而可以在黑暗条件下进行复制,但病毒粒子的释放量减少了50%。就感染P.pouchetii和H.akashiwo的病毒而言,光限制对其子代病毒的感染性和裂解周期的长短都没有影响,但光限制下这种P.pouchetii病毒粒子的释放量会有所降低。另外,有趣的是,感染P.pouchetii的病毒的产量不依赖于宿主细胞周期的运行,而感染P.orientalis的病毒的产量是宿主细胞周期依赖性的。正象DNA合成和有丝分裂起始一样,微藻的细胞周期经常是被同步化的并依赖于光周期。在光照开始进行感染的培养中病毒的产量是黑暗开始时的感染培养的8倍。18～20d的潜伏期长度不受细胞周期的影响。光照开始时的感染培养在黑暗期开始裂解,因而避免了长时间暴露于光照和紫外线辐射对(病毒)感染性的损伤。Suttle将此假设用于解释1个发现,即Synechococcusspp.噬菌体产量不稳定可能是由于白天病毒的感染性受到损伤所致。对宿主细胞周期的不同反映是否是病毒控制宿主种群密度的1种机制(自然界中P.pouchetii是1种赤潮藻,而P.orientalis则常处于较低丰度)尚需进一步探讨。温度可以改变病毒的感染性,但不同的病毒—宿主系统对温度变化的反应大不一样。感染H.akashiwo的病毒,其感染性随着储存时间的延长和储存温度的升高(5～25℃)而急剧下降。而感染绿藻Chlorella的病毒,保存在4℃下至少1年之内仍保持感染性。另外,宿主细胞的生长条件也会影响病毒和宿主之间的相互作用,处于稳定生长期的宿主细胞病毒粒子的释放量会减少。更有甚者,指数生长后期的赤潮藻H.akashiwo对病毒感染非常敏感,但在稳定生长期,只能保持1个病毒克隆。这些研究表明,宿主的生理状况对病毒的感染性以及病毒感染后的增殖有重要影响。营养耗尽或限制会明显地改变藻类细胞的生理状况,因此潜在地改变了病毒感染的动力学。磷酸盐耗尽时,Synechococcusspp.细胞的裂解后滞约18h,并且病毒滴度至少会减少60%。有些宿主在硝酸盐耗尽时同样也会使病毒的滴度降低,但变化较小(25%)。磷酸盐损耗导致的病毒释放量减少并不伴随着噬菌体吸附的减少,因此可能生理状况较差的宿主细胞会触发溶原现象。对真核微藻P.pouchetii和E.huxleyi的研究也显示,磷酸盐胁迫下病毒粒子的释放量会有所减少。硝酸盐耗尽后也导致P.poucheti病毒粒子释放量的减少,但对E.huxleyi没有影响。众所周知,棕囊藻的生长周期中具有胶群体和游动性的单细胞2个阶段,而且其群体形态多变。位于胶群体内的细胞很少被病毒感染,但当营养不足时,群体分散,大量的单细胞释放出来后促进病毒感染并导致裂解率的迅速提高。自然界中,微藻经常会受到营养限制的影响,也是赤潮发展的主要因素之一,因此营养耗尽对病毒—宿主细胞相互作用的影响也是未来需要进一步研究的领域。另外,研究表明,紫外线辐射也会影响病毒与P.pouchetii之间的相互作用,而且与紫外线的种类有关,UV-B辐射能够显著抑制病毒的感染性,而UV-A则没有影响。1个有趣的发现是,先前逃脱病毒感染的P.pouchetii对UV-B胁迫的敏感性会有所降低。理论上讲,这些对病毒和紫外线具有抗性的宿主细胞与敏感性细胞相比将有很大优势。(然而)他们又不是种群中的优势种这一事实表明:一定存在1个反向的平衡,可能是由于对营养较低的亲和力使这些抗性细胞的生长率比较低所致。显然,应用宿主-病毒系统模型,对于了解病毒对藻类宿主种群的控制机制及影响至关重要。4病毒的结构和功能目前对病毒介导的微藻死亡及其机制的研究还很少,病毒的裂解作用为微藻原位损失率的精确估计带来困难。假如病毒诱导的藻类死亡确实依赖于病毒和宿主细胞的丰度,与能形成高密的赤潮种相比,建立低密度藻种的病毒宿主-模型系统具有深远意义。新近