现代生物分析技术5概论课件

2023/9/12第五章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱仪HPLC二、高效液相色谱法的特点featureofHPLC三、流程及主要部件generalprocessandmainassemblyofHPLC第一节

高效液相色谱的特点与仪器highperformanceliquidchromatographfeatureandinstrumentofHPLC2023/7/31第五章

高效液相色谱分析法一、高效液相色谱2023/9/12一、液相色谱仪器

highperformanceliquidchromatograph2023/7/31一、液相色谱仪器

highperfor2023/9/12液相色谱仪（2）2023/7/31液相色谱仪（2）2023/9/12液相色谱仪（3）2023/7/31液相色谱仪（3）2023/9/12液相色谱仪（4）2023/7/31液相色谱仪（4）2023/9/12TypesofLiquidChromatographyGravityChrom.Tsvett,1903FlashChrom.1978Waters1525UPLC2004(TLC)PaperChrom.2023/7/31TypesofLiquidChrom2023/9/12二、高效液相色谱法的特点

featureofHPLC

特点：高压（15-35MPa）、高效（大于30000塔板/米）、高灵敏（10-9紫外检测，10-11荧光检测）高沸点、热不稳定有机及生化试样（>80%）的高效分离分析方法。2023/7/31二、高效液相色谱法的特点

feature2023/9/122023/7/312023/9/12气相色谱和高效液相色谱的比较气相色谱高效液相色谱1.只能分析挥发性的物质，只能分析20%的化合物几乎可以分析各种物质2.不能用于热不稳定物质的分析可用于热不稳定物质的分析3.用毛细管柱色谱可得到很高的柱效色谱柱不能很长柱效不会很高4.有很灵敏的ECD和较灵敏的FID和TCD没有很高灵敏度的检测器5.流动相无毒，易于处理流动相有毒，费用较高6.运动操作容易比GC难7.仪器制造难度较小制造难度较大8.温度梯度溶剂梯度9.不参加分离。参加分离2023/7/31气相色谱和高效液相色谱的比较现代生物分析技术5概论课件CHROMATOGRAPHYQuantityvsResolutionvsSpeedCHROMATOGRAPHY2023/9/12三、流程及主要部件

processandmainassemblyofHPLC1.流程2023/7/31三、流程及主要部件

processan2023/9/12色谱柱进样阀流动相检测器高压泵脱气装置2.主要部件2023/7/31色谱柱进样阀流检测器高压泵脱气装置2.主2023/9/12（1）流动相贮罐

常使用1L的锥形瓶，在连接到泵入口处的管线上时要加一个吸滤头(2um过滤芯)，以防止溶剂中的固体颗粒进入泵。2.主要部件使用高纯度的流动相脱去流动相中的溶解气体高效液相色谱的流动相

选择流动相时，首先要考虑溶剂的物理性质，如沸点，粘度，紫外吸收的波长范围；其次要考虑的是溶剂对所要分离样品的容量因子。一般来说选择较低沸点和较低粘度的溶剂2023/7/31（1）流动相贮罐2.主要部件使用高纯度的流吸滤头2023/9/12吸滤头的清洗方法：用异丙醇（或5～10％稀硝酸），超声波清洗5分钟，再用蒸馏水清洗。吸滤头2023/7/31吸滤头的清洗方法：用异丙醇（或5～1保存于棕色玻璃瓶中的超纯水保存于棕色玻璃瓶中的超纯水2023/9/12(2)高压输液泵主要部件之一，压力：150～350×105

Pa。为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（<10μm），液体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高速是高效液相色谱的特点之一。应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性（动画）2023/7/31(2)高压输液泵（动画）2023/9/12梯度淋洗装置外梯度（高压梯度）:

利用两台高压输液泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。内梯度（低压梯度）:一台高压泵,通过比例调节阀,将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。2023/7/31梯度淋洗装置外梯度（高压梯度）:2023/9/12(3)进样装置

流路中为高压力工作状态，通常使用耐高压的六通阀进样装置，其结构如图所示：2023/7/31(3)进样装置流路中为高进样方法整个定量圈体积进样——为获得好的精密度，进样量应大于定量圈量的2-5倍以上。由于层流影响，需要有过量的样品液来取代管壁上的流动相。SampleMobilephase进样方法SampleMobilephase部分定量圈体积进样——当样品量少时，采用部分体积进样，进样量由微量注射器手动控制，要求：不得超过定量圈体积的1/2量例20l定量圈，进样体积不能超过10l。否则，部分样品将会从出口流失。这是因为由于层流的关系，样品流经管中心的速度是平均速度的两倍。进样前应用流动相冲洗进样孔，以除去前一针留下的样品。注射针必须清洗干净。部分定量圈体积进样——当样品量少时，采用部分体积进样，进样量Agilent1100系列自动进样器不同进样体积下的峰面积精度见下图13579102550100进样体积（

l）RSD%Agilent1100系列自动进样器不同进样体积下的峰面积2023/9/12(4)高效分离柱

柱体为直型不锈钢管，内径1～6mm，柱长5～40cm。发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。2023/7/31(4)高效分离柱柱体为2023/9/12(5)液相色谱检测器

a.紫外检测器（ultravioletphotometricdetector，UV）应用最广（70%），对大部分有机化合物（80%）有响应，属浓度敏感型检测器。特点：

灵敏度高；线形范围宽；流通池可做的很小（1mm×10mm，容积8μL）；

对流动相的流速和温度变化不敏感；波长可选，易于操作；可用于梯度洗脱。

2023/7/31(5)液相色谱检测器a.紫外检2023/9/12紫外-可见光检测器（UV-Vis）原理：紫外—可见光检测器是通过测定样品待测组分在检测池中对特定波长紫外光的选择性吸收的大小来确定样品含量的待测组分的浓度与吸光度的关系服从郎伯—比耳定律

A=abc=lgI0/I=lg1/Ta—吸光系数，b—光在溶液中的距离，c—浓度

A=bc[为摩尔消光系数L/(mol·cm)]生色团（或发色团）它们都含有不饱和键或未共用电子对，能产生-＊及n-＊的跃迁。如：C=C、C=O、S–C、C=N、N=N、N=O等助色团某些基团本身不产生吸收峰，但与生色团相连时，常常引起吸收峰位移和吸收强度改变，这些基团称为助色团。如：羟基、烃氧基、氨基、烷氧基、芳氨基等2023/7/31紫外-可见光检测器（UV-Vis）原理：2023/9/122023/7/312023/9/12b.光电二极管阵列检测器（photo-diodearray，PDA）紫外检测器的重要进展；光电二极管阵列检测器：1024个二极管阵列，各检测特定波长，计算机快速处理，三维立体谱图，如图所示。2023/7/31b.光电二极管阵列检测器（photo-d2023/9/12

PDA原理和结构在结构上的主要特点是用光电二极管阵列同时接受来自源通池的全光谱透过光。然后由一系列分光技术，使所有波长的光在接收器同时被检测。它在结构和光路安排上与普通的紫外检测器有重要区别，样品与光栅的相对位置正好相反，经常称为“倒光学”系统。2023/7/31PDA原理和结构2023/9/122023/7/312023/9/12光电二极管阵列检测器2023/7/31光电二极管阵列检测器2023/9/12色谱图minH光谱图nmAA-λ曲线(定性)A-t曲线(定量)2023/7/31色谱图minH光谱图nmAA-λ曲线A-t2023/9/12色谱图光谱图2023/7/31色谱图光谱图2023/9/12DADUV2023/7/31DADUV2023/9/12c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）示差折光效应：任意一束光由一种介质射入另一种介质时，由于两种介质的折射率不同而发生折射现象。示差折光检测器是通过连续测定色谱柱流出液的折射率的变化而对样品浓度进行检测的。折射率（refractiveindex）是一个无量纲的常数，光在真空中的速度和光在某种介质中的速度之

比为该介质的折射率，其大小表

明了介质光学密度的高低。2023/7/31c.示差折光检测器（different2023/9/12c.示差折光检测器（differentialrefractiveindexdetector）除紫外检测器之外应用最多的检测器；

可连续检测参比池和样品池中流动相之间的折光指数差值。差值与浓度呈正比。浓度型检测器；

通用型检测器；有偏转式、反射式和干涉型三种；2023/7/31c.示差折光检测器（different2023/9/12示差折光检测器2023/7/31示差折光检测器示差折光检测器（RID）

特点2023/9/121、

响应值取决于柱后流出液的折射率的变化，采用含有样品的流出液与不含样品的流出液的同一物理量的示差测量。可分析各类样品如：高分子化合物、糖、脂肪烷烃、聚乙烯、聚乙二醇和丁苯橡胶；2、与uv比，灵敏度较低，不适于痕量分析；3、对压力和温度变化敏感，介质的折射率随温度升高而降低；4、不能用于梯度洗脱。示差折光检测器（RID）特点2023/7/311、响应值2023/9/12粉红线：水－乙腈蓝色线：水－甲醇2023/7/31粉红线：水－乙腈2023/9/122023/7/312023/9/12d.荧光检测器（fluorescencedetector）

高灵敏度（10-13g）

、高选择性；荧光化合物：具有对称共轭体系的分子；具有芳香环并带有给电子取代基的化合物或具有共轭不饱和体系的化合物（-OH,-NH2,-OCH3,-NR2等）。如对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。2023/7/31d.荧光检测器（fluorescenc2023/9/12荧光检测器原理所谓荧光是指某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的某些电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的某些振动能级。电子在同类分子或其它分子中撞击，消耗了相当的能量，从而降到第一激发态中的最低振动能波，同时发射比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。原理：液相色谱中的荧光检测器仅使用吸收紫外光或可见光而发射的荧光，利用测量化合物荧光强度对化合物进行检测。2023/7/31荧光检测器原理所谓荧紫外检测器，波长265nm；荧光检测器，激发波长265nm，发射波长520nm。紫外检测器，波长265nm；2023/9/12e.蒸发光散射检测器（ELSD）

通用型、质量型、破坏型原理：组分先引入已通气体（N2,空气）的蒸发室，加热，使流动相蒸发而被除去，样品组分形成气溶胶而产生光散射，光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子大小而进行测量的，又成为蒸发型质量检测器。(不符合朗伯－比尔定律）三步：雾化－蒸发－检测样品组分须为非挥发性或半挥发性的，流动相是易挥发的溶剂。蒸发光散射检测器适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。2023/7/31e.蒸发光散射检测器（ELSD）2023/9/12蒸发光散射检测器结构2023/7/31蒸发光散射检测器结构2023/9/12f.电化学检测器（ECD）

适用范围：没有紫外吸收或不能发生荧光但具有电活性的物质，可采用电化学检测方法。分类安培检测器极谱检测器库仑检测器电导检测器2023/7/31f.电化学检测器（ECD）检测器比较2023/9/12DetectorTypeRIELSDUV/VISFluore-scentECDMSLOD(ng/injection)100110.01-0.10.010.01SelectivityNoNoModerateVeryHighHighHighGradientElutionNoYesYesYesNoYes检测器比较2023/7/31DetectorTypeRIE(6)馏分收集器2023/9/12(6)馏分收集器2023/7/312023/9/12第五章

高效液相色谱分析法一、液-固吸附色谱liquid-solidadsorptionchromatograph二、液-液分配色谱liquid-liquidpartitionchromatograph三、离子交换色谱ion-exchange

chromatograph四、离子色谱ionchromatograph五、离子对色谱ion-pairchromatograph六、排阻色谱size-exclusionchromatograph七、亲和色谱(AC)Affinity

chromatograph第二节

主要分离类型与原理highperformanceliquidchromatographbasicprincipleandmainseparatingtypes2023/7/31第五章

高效液相色谱分析法一、液-固吸附色2023/9/12一、液-固吸附色谱

liquid-solidadsorption

chromatography

固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使用的是5～10μm的硅胶吸附剂；

流动相：各种不同极性的一元或多元溶剂。

基本原理：组分在固定相吸附剂上的吸附与解吸；适用于分离相对分子质量中等的油溶性试样，对具有官能团的化合物和异构体有较高选择性；

缺点：非线形等温吸附常引起峰的拖尾；2023/7/31一、液-固吸附色谱

liquid-sol2023/9/12二、液-液分配色谱

liquid-liquidpartition

chromatography固定相与流动相均为液体（互不相溶）；

基本原理：组分在固定相和流动相上的分配；

流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性（正相

normalphase），反之，流动相的极性大于固定液的极性（反相

reversephase）。正相与反相的出峰顺序相反；

固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；

化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。如：C-18柱（反相柱）。2023/7/31二、液-液分配色谱

liquid-li2023/9/12正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中等极性流动相中等极性流动相时间时间时间时间待测物极性：A>B>C正、反相色谱中极性和保留时间的关系2023/7/31正相色谱低极性流动相反相色谱高极性流动相中2023/9/12三、离子交换色谱

ion-exchange

chromatography

固定相：阴离子离子交换树脂或阳离子离子交换树脂；

流动相：阴离子离子交换树脂作固定相，采用酸性水溶液；阳离子离子交换树脂作固定相，采用碱性水溶液；

基本原理：组分在固定相上发生的反复离子交换反应；组分与离子交换剂之间亲和力的大小与离子半径、电荷、存在形式等有关。亲和力大，保留时间长；阳离子交换：R—SO3H+M+=R—SO3M+H+

阴离子交换：R—NR4OH+X-=R—NR4X+OH-

应用：离子及可离解的化合物，氨基酸、核酸等。2023/7/31三、离子交换色谱

ion-exchang2023/9/12四、离子色谱

ionchromatography

离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，是测定混合阴离子的有效方法。有关内容将在第五节中讲授。2023/7/31四、离子色谱

ionchromatog2023/9/12五、离子对色谱

ionpairchromatography

原理：将一种（或多种）与溶质离子电荷相反的离子（对离子或反离子）加到流动相中使其与溶质离子结合形成疏水性离子对化合物，使其能够在两相之间进行分配；

阴离子分离：常采用烷基铵类，如氢氧化四丁基铵或氢氧化十六烷基三甲铵作为对离子；

阳离子分离：常采用烷基磺酸类，如己烷磺酸钠作为对离子；

反相离子对色谱：非极性的疏水固定相(C-18柱)，含有对离子Y+的甲醇-水或乙腈-水作为流动相，试样离子X-进入流动相后，生成疏水性离子对Y+

X-后；在两相间分配。2023/7/31五、离子对色谱

ionpairchr2023/9/12I-(m)+D+(m)离子对模型固定相（s）流动相（m）DI（m）DI（s）疏水作用反离子药物离子离子对2023/7/31I-(m)离子对模型固流动相（m）DI（2023/9/12六、排阻色谱色谱

size-exclusionchromatography

固定相：凝胶(具有一定大小孔隙分布)；

原理：按分子大小分离。小分子可以扩散到凝胶空隙，由其中通过，出峰最慢；中等分子只能通过部分凝胶空隙，中速通过；而大分子被排斥在外，出峰最快；溶剂分子小，故在最后出峰。全部在死体积前出峰；可对相对分子质量在100-105范围内的化合物按质量分离2023/7/31六、排阻色谱色谱

size-exclu2023/9/12七、亲和色谱(AC)

Affinitychromatograph

原理：利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。

先在载体表面键合上一种具有一般反应性能的所谓间隔臂(环氧、联胺等)，再连接上配基(酶、抗原等)，这种固载化的配基将只能和具有亲和力特性吸附的生物大分子作用而被保留。改变淋洗液后洗脱。2023/7/31七、亲和色谱(AC)

Affinity2023/9/12第五章

液相色谱分析法一、液相色谱固定相stationaryphaseofHPLC二、液相色谱流动相

mobilephaseofHPLC第三节

液相色谱的固定相与流动相highperformanceliquidchromatographstationaryphaseandmobilephaseofHPLC2023/7/31第五章

液相色谱分析法一、液相色谱固定相第2023/9/12一、液相色谱固定相

stationaryphasesofLC

1.液-液分配及离子对分离固定相（1）全多孔型担体

由氧化硅、氧化铝、硅藻土等制成的多孔球体；早期采用100μm的大颗粒，表面涂渍固定液，性能不佳已不多见；现采用10μm以下的小颗粒，化学键合制备柱填料；（2）表面多孔型担体（薄壳型微珠担体）

30～40μm的玻璃微球，表面附着一层厚度为1～2μm的多孔硅胶。表面积小，柱容量底；2023/7/31一、液相色谱固定相

stat2023/9/12（3）化学键合固定相化学键合固定相:目前应用最广、性能最佳的固定相；

a.硅氧碳键型：≡Si—O—C

b.硅氧硅碳键型：≡Si—O—Si—

C

稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；

c.硅碳键型：≡Si—C

d.硅氮键型：≡Si—N2023/7/31（3）化学键合固定相化学键合2023/9/12化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快；（2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；（3）耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定；（4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；（5）有利于梯度洗脱；存在着双重分离机制：疏溶剂理论和双保留机制（疏溶剂和亲硅醇基效应），键合基团的覆盖率决定分离机理。高覆盖率：分配为主；低覆盖率：吸附为主；

2023/7/31化学键合固定相的特点（1）传质快，表面无深C18柱2023/9/12C18柱2023/7/312023/9/122023/7/31反相与正相色谱固定相2023/9/12反相与正相色谱固定相2023/7/312023/9/122.液-固吸附分离固定相

种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等；结构类型：全多孔型和薄壳型；粒度：5～10μm；

2023/7/312.液-固吸附分离固定相种类2023/9/123.离子交换色谱分离固定相

结构类别：（1）薄壳型离子交换树脂薄壳玻璃珠为担体，表面涂约1%的离子交换树脂；（2）离子交换键合固定相薄壳键合型；微粒硅胶键合型（键合离子交换基团）

树脂类别：（1）阳离子交换树脂（强酸性、弱酸性）（2）阴离子交换树脂（强碱性、弱碱性）2023/7/313.离子交换色谱分离固定相结构2023/9/124.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶葡聚糖凝胶、琼脂凝胶等。多孔网状结构；水为流动相。适用于常压排阻分离。（2）半硬质凝胶苯乙烯-二乙烯基苯交联共聚物，有机凝胶；非极性有机溶剂为流动相，不能用丙酮、乙醇等极性溶剂（3）硬质凝胶多孔硅胶、多孔玻珠等；化学稳定性、热稳定性好、机械强度大，流动相性质影响小，可在较高流速下使用。可控孔径玻璃微球，具有恒定孔径和窄粒度分布。2023/7/314.空间排阻分离固定相（1）软质凝胶2023/9/122023/7/312023/9/12二、液相色谱的流动相

mobilephasesofLC1.流动相特性

（1）液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂。流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况；（2）亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定相的极性，称为正相液液色谱法，极性柱也称正相柱。（3）若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液液色谱，非极性柱也称为反相柱。组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。2023/7/31二、液相色谱的流动相

mo2023/9/122.流动相类别

按流动相组成分：单组分和多组分；

按极性分：极性、弱极性、非极性；

按使用方式分：固定组成淋洗和梯度淋洗。

常用溶剂：己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。2023/7/312.流动相类别按流动相2023/9/123.流动相选择

在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。采用正相液-液分配分离时：首先选择中等极性溶剂，若组分的保留时间太短，降低溶剂极性，反之增加。也可在低极性溶剂中，逐渐增加其中的极性溶剂，使保留时间缩短。

常用溶剂的极性顺序：水(最大)>甲酰胺>乙腈>甲醇>乙醇>丙醇>丙酮>二氧六环>四氢呋喃>甲乙酮>正丁醇>乙酸乙酯>乙醚>异丙醚>二氯甲烷>氯仿>溴乙烷>苯>四氯化碳>二硫化碳>环己烷>己烷>煤油(最小)2023/7/313.流动相选择在选择溶剂2023/9/124.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化铝固定相等。（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。2023/7/314.选择流动相时应注意的几个问题（1）尽例：反相色谱流动相优化1、有机相强度选择先用强溶剂（如100%乙腈）洗脱一定时间（约30min），以保证非极性强保留成分完全被洗脱，然后以20%的比例递减有机相比例，根据经验规律（称为3的规律）：有机相降低10%，k’增加约3倍，可以较快找到较合适的有机相比例。或采用梯度洗脱（5%-100%有机相）进行首次实验。例：反相色谱流动相优化甲醇%乙腈%四氢呋喃%相对容量因子

0001001064402014101630221764032232.550403016050370.47060450.28073530.069086630.03100100720.01RH-HPLC等溶剂强度混合物甲醇%乙腈%四氢呋喃

甲醇-水

四氢呋喃-水

乙腈-水

2、有机相选择：

保持强度不变，更换有机相种类。

：-=1：1；：-=1：1

：-=1：1；：--=1：1：1甲醇-水四氢呋喃-水乙腈-水2、有机相选2023/9/12第五章

液相色谱分析法一、影响分离的因素factorsinfluencedseparation二、分离类型的选择choiceofseparationtypes三、液相色谱的应用applicationofHPLC四、液相制备色谱preparativeliquidchromatography第四节

影响分离的因素与操作条件的选择highperformanceliquidchromatograph

factorsinfluencedseparationandchoiceofoperationcondition2023/7/31第五章

液相色谱分析法一、影响分离的因素第2023/9/12一、影响分离的因素

factorsinfluencedseparation1.影响分离的因素与提高柱效的途径

在高效液相色谱中,液体的扩散系数仅为气体的万分之一，则速率方程中的分子扩散项B/U较小，可以忽略不计，即：

H=A+Cu故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所示。2023/7/31一、影响分离的因素

factorsin2023/9/12液体的黏度比气体大一百倍，密度为气体的一千倍，故降低传质阻力是提高柱效主要途径。由速率方程，降低固定相粒度可提高柱效。液相色谱中，不可能通过增加柱温来改善传质。恒温改变淋洗液组成、极性是改善分离的最直接的因素。2023/7/31液体的黏度比气体大一百倍2023/9/122.流速流速大于0.5cm/s时,H～u曲线是一段斜率不大的直线。降低流速，柱效提高不是很大。但在实际操作中，流量仍是一个调整分离度和出峰时间的重要可选择参数。

3.固定相及分离柱

气相色谱中的固定液原则上都可以用于液相色谱，其选用原则与气相色谱一样。但在高效液相色谱中，分离柱的制备是一项技术要求非常高的工作，一般很少自行制备。2023/7/312.流速流速大于0.5cm粒径影响2023/9/12粒径影响2023/7/312023/9/12pH影响保留时间1.Salicylicacid2.Phenobarbitone3.Phenacetin4.Nicotine5.Methylampohetamine30x0.4cmC-18,10mm,2mL/min,UV220nmSnyderandKirkland,IntroductiontoModernLiquidChromatography,Wiley,1979,p.288.2023/7/31pH影响保留时间1.SalicylicRP-HPLC：等度洗脱2023/9/12A:KH2PO4(aq)

B:CH3CN(l)RP-HPLC：等度洗脱2023/7/31A:KH2PORP-HPLC：梯度洗脱2023/9/12RP-HPLC：梯度洗脱2023/7/312023/9/12二、分离类型选择

choiceofseparationtypes2023/7/31二、分离类型选择

choiceofs2023/9/12三、HPLC的应用

applicationofHPLC

1.环境中有机氯农药残留量分析

固定相：薄壳型硅胶(37～50m)流动相：正己烷流速：1.5mL/min色谱柱：50cm2.5mm(内径)检测器：示差折光检测器

可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。2023/7/31三、HPLC的应用

applicati2023/9/122.稠环芳烃的分析

稠环芳烃多为致癌物质。

固定相：十八烷基硅烷化键合相流动相：20%甲醇-水～100%甲醇线性梯度淋洗，2%/min

流速：1mL/min

柱温：50ºC柱压：70104Pa

检测器：紫外检测器2023/7/312.稠环芳烃的分析稠环芳烃多为2023/9/12四、制备型液相色谱

preparativeliquidchromatography

获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。半制备柱（内径8mm，长度15～30cm），一次制备量０.1～１mg；1.色谱柱的柱容量（柱负荷）对分析柱：不影响柱效时的最大进样量；

对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量；

超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。

超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。2023/7/31四、制备型液相色谱

preparativ柱效：H=L/N2023/9/12柱效：H=L/N2023/7/312023/9/122.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有以下情况：

（1）可获得良好分离，主峰使用制备柱，超载提高效率；（2）两主成分之间的小组分；超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。

2023/7/312.液相制备色谱的方法收集组分时，通常有2023/9/123.制备型液相色谱

制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。

制备柱：内径20～50mm，柱长50cm。2023/7/313.制备型液相色谱制2023/9/12第五章

液相色谱分析法一、离子色谱法原理principleofIC二、离子色谱连续抑制装置suppressed

apparatusofIC三、离子色谱的应用applicationofIC第五节

离子色谱法highperformanceliquidchromatographionchromatograph,IC2023/7/31第五章

液相色谱分析法一、离子色谱法原理第2023/9/12离子色谱仪2023/7/31离子色谱仪2023/9/12一、离子色谱法原理

principleofIC(IonChromatography,简称IC)以无机、特别是无机阴离子混合物为主要分析对象,在七十年代出现、八十年代迅速发展。

传统离子交换色谱存在着两个难于解决的问题：(1)需要高浓度淋洗液洗脱且洗脱时间很长；(2)洗脱后的组分缺乏灵敏、快速的在线检测方法。2023/7/31一、离子色谱法原理

2023/9/121.离子色谱法原理离子交换原理，与传统离子交换的不同点：采用交换容量非常低的特制离子交换树脂为固定相；细颗粒柱填料，高柱效；采用高压输液泵；低浓度淋洗液或本底电导抑制（在分离柱后，采用抑制柱来消除淋洗液的高本底电导）；可采用电导检测器，快速分离分析微量无机离子混合物；各种抑制装置及无抑制方法的出现，发展迅速。2023/7/311.离子色谱法原理离子交换原理，与2023/9/122.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快

可在数分钟内完成一个试样的分析；（2）分离能力高

在适宜的条件下，可使常见的各种阴离子混合物分离；例：使用双柱法，在十几分钟内，可使七种阴离子完全分离。（3）分离混合阴离子的最有效方法（4）耐腐蚀，仪器流路采用全塑件，玻璃柱2023/7/312.离子色谱具有以下优点（1）分析速度快2023/9/12二、离子色谱装置类型

suppressedapparatusofIC抑制型：抑制柱型、连续抑制型分离柱中离子交换树脂的交换容量通常在0.01～0.05毫摩尔/克干树脂。非抑制型:当进一步降低分离柱中树脂的交换容量(0.007～0.07毫摩尔/克干树脂),使用低浓度、低电离度的有机弱酸及弱酸盐作淋洗液，如苯甲酸、苯甲酸盐等。检测器可直接与分离柱相连，不需抑制柱。2023/7/31二、离子色谱装置类型

suppre2023/9/12离子色谱连续抑制装置图2023/7/31离子色谱连续抑制装置图2023/9/12离子色谱连续抑制原理图2023/7/31离子色谱连续抑制原理图2023/9/12三、离子色谱的应用

applicationofIC阴离子分析:

双柱；薄壳型阴离子交换树脂分离柱(3×250mm),流动相：0.003mol·L-1NaHCO3/0.0024mol·L-1Na2CO3，流量138mL/hr。七种阴离子在20分钟内基本上得到完全分离，各组分含量在3～50ppm。2023/7/31三、离子色谱的应用

applicatio2023/9/12第五章

液相色谱分析法一、超临界流体色谱的特点与原理featureandprincipleofSFC二、超临界流体色谱仪的结构流程structureandgeneralprocessofSFC

三、超临界流体色谱的应用applicationofSFC第六节

超临界色谱highperformanceliquidchromatographsupercriticalfluidchromatograph,SFC2023/7/31第五章

液相色谱分析法一、超临界流体色2023/9/12一、超临界流体色谱的特点与原理

principleandcharacterofsupercriticalfluid