fame国外先进设备的研制

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采集的血液的采样量大，客观上存在人为误差。因此，血液检测的标准化、规范化和自动化始终是血液检测的目标。为此,我中心先后购进STAR全自动加样器及FAME全自动酶免分析仪器各2台,针对STAR全自动加样仪器和FAME全自动酶免分析仪器采用正交试验设计的方法,优化最佳试验参数,建立了具有我国特点的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP四项免疫自动化检测系统,不仅实现了试剂国产化,而且提高了血站检验的整体检测水平。报告如下。1材料和方法1.1测试对象郑州市无偿献血者所捐献的血液。1.2bsag和抗-hcvaa试剂盒STAR全自动加样器和FAME全自动酶免分析系统(瑞士Hamilton公司);HBsAg和抗-HCVEIA试剂盒(北京万泰和上海科华公司);抗-HIVEIA试剂盒(荷兰梅里埃和北京万泰公司);抗-TPEIA诊断试剂盒(北京吉比爱);340RT和HTⅢ酶标仪(奥地利Anthos公司);一次性针头(北京奥斯邦公司)。1.3投资前加样方法初检:STAR加样器采用一次性加样针头加样,加抗-HIV(伯乐)、HBsAg和抗-HCV(万泰),在340RT酶标仪上读板。复检:STAR加样器采用钢针加样针头加样,加抗-TP(吉比爱)、抗-HIV(万泰)、抗-HCV和HBsAg(科华),在HT3酶标仪上读板。STAR钢针有3组针循环冲洗使用(每组8个针),加抗-HCV稀释液和HBsAg酶是第1组针,加抗-TP工作液是第2组针,加样按2、3、1组进行轮换提针,加完4项阴阳对照需1、2、3组提针,加样顺序为:TP→HIV→HCV→HBV。如果有拖带污染:重新取小瓣进行复查确认。2结果2.1萃取参数的选择2.1.1稀释液时加样钢针分离技术的改进当用STAR全自动加样器采用常规的液体模式加高粘稠度的稀释液时,加样钢针在分配液体过程中往下掉液体,为此,对常规的液体模式进行研究,优选出新的吸液分配液体模式,该模式可克服上述不足。见表1。2.1.2喷流式的设置将“分配”图标拖到吸液命令下面的位置中,弹出对话框(见图1)。选择“ML_STAR”作为分配到目标板的序列。为通道选择及序列方式选择与吸液的设置。输入体积的量(Volume),选择分配模式“喷射排空”。将图1中的“Fixheightfrombottom”数字6按抗-TP、抗-HIV、抗-HCV、HBsAg依次改为2、4、4、2mm。然后单击图2中“Advanced”,出现图2的对话框。将图2中的“Liquidfollowingduringdispense”中的“on”改为“off”。2.2经过修正，检测了双孔样品的实验编程2.2.1样本配置STAR的样本架是条形架,每架可排布32个样本,按照顺序先排布日常样本,再排布再检样本。2.2.2f列和g列计算无线网络关联的样本需要再检对于再检样本,需要编辑Excel工作表,通过Excel工作表对再检样本进行编号,并编辑再检样本的再检项目及所需的体积,见图3。A列为再检样本的序号,B列、C列、D列和E列下为再检项目,其中“1”表示需要再检,“0”表示不需要再检,F列和G列表示样本的体积,其中F2输入公式“=B2*50+C2*50+D2*10+E2*50”,采用相对引用的方式复制该公式至F列其他单元格。G2输入公式“=F2*2”,采用相对引用的方式复制该公式至G列其他单元格。如第1个样本需要再检的项目是抗-HIV,需要样本的体积单孔为50μl,双孔为100μl;第2个样本需要再检的项目是抗-TP,需要样本的体积单孔为50μl,双孔为100μl;第7个样本需要再检的项目是抗-HIV和抗-HCV,需要样本的体积单孔为60μl,双孔为120μl。2.2.3组成字符的加害仪器操作软件自动打开再检Excel工作表,读取各个项目,组成字符串。依次读取抗-HIV、HBsAg、抗-TP、抗-HCV的再检样本数,并计算各个项目要做样本的总数(包括正常样品数和再检样品数),依此决定稀释液和酶的分配孔数。2.2.4初检和再检样品总起始位“number”为正常样品的个数,“number_all”为正常样品和再检样品的总数。样品的起始位为132,终止位为133。正常样本数有单数和双数2种情况,那么再检样本的在酶标板定位就不同,1个mediate1,1个mediate2。2.2.5酶标板再检序列的分配首先通过Excel工作表读取再检样本的体积,将液体分配到两个序列中。以抗-HIV为例,8个通道依次读取再检样本,确定分配体积,然后从再检样本序列ML_STARsamples_zj中吸取样品,并将样品分配到酶标板ML_STARTarget_HIV_sample_zj_S和MLSTARTargetHIVsamplezj_D再检序列中。见图4。2.3阴阳比较产品的试验编程以相同的间隔进行分配2.3.1试管架和试管架的布置在工作台面上添加器件car32_cup12×100.rck,按照微板设定的阴性、阳性对照及质控品的顺序在试管架上排布各阴性、阳性对照及质控品。2.3.2微生物板上的plese-ples-ples的基本成分构建在序列编辑器中,对照品条架上建立序列Nc_Pc_strip(包含对照品条架HBsAg、抗-HCV、抗-TP的阴性及阳性对照)、序列Qc_Pc1_Pc2_strip(包含对照品条架HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP的质控对照及的抗-HIV阳性对照1和阳性对照2),同样在微孔板载架建立序列Nc_Pc_plate_1(包含HBsAg、抗-HCV、抗-TP的微孔板上的阴性及阳性对照的1个孔)、Nc_Pc_plate_2(包含HBsAg、抗-HCV、抗-TP的微孔板上的阴性及阳性对照的另1个孔)、Qc_Pc1_Pc2_plate(包含HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP微孔板上的质控对照及抗-HIV的阳性对照1和阳性对照2)。2.3.3序列组合分配在方法编辑器中,吸取序列Nc_Pc_strip的样品对序列Nc_Pc_plate_1和Nc_Pc_plate_2进行分配。吸取序列Qc_Pc1_Pc2_strip的样品对序列Qc_Pc1_Pc2_plate进行分配。2.4液体校正曲线的确定校正量通常由重量分析来决定的。因此,105μl的校正量并不意味着会分配105μl的液体。当加样尖被排空时,分配量为100μl。校正主要是通过调整液体上方的1段空气柱。优化后Sample校正曲线的数值10μl修改为16μl,20~750μl上调30%;1000μl不变。2.5洗板效果的修改洗涤效果不好或出现花板,应重新测量微板的尺寸(表2)后进行修改,如果洗板效果还不好,将“底部扫洗”、“底部洗板”和“连续洗涤”部分或全部选上。同时将“洗液动力”、“注液动力”、“注液时的洗液动力”均选中或选高。吸液高度调整为0.1mm。2.6fme24和20多个操作流程的讨论2.6.1进板间间间隔HBV、HCV、HIV有6种进板排列组合模式,例如:HCV、HIV、HBV组合表示依次进入FAME的顺序,然后按此顺序交替进12板,以下类同。进板时间间隔指的是:在编程序时,每板之间的时间间隔,本试验仅对第4板时间间隔进行选择,其余每板之间时间间隔设置均为0min。每种进板组合,不同的进板顺序和板与板的间隔时间对总的操作时间的影响。结果显示,12板按HIV、HCV、HBV交替进板,进板时间间隔为5min下的“新时间”以及10min下的“原时间”,总的处理时间最短,同时两者时间相差7(155~148)min。最后1架按HBV、HIV、HCV顺序进板,总的处理时间最短,时间又提前10(148~138)min。2.6.2显色剂的选择试剂位置的指定原则是:洗板后在同一位置接着加酶或显色剂,因此,洗板单元和酶以及显色剂应在同一单元中,当显色剂是A和B液时,由于A和B显色剂是连续分配,FAME软件不允许在同一单元连续进行,因此,显色剂A和B不能放在同一单元中,遵照这种规律,本试验的试剂存放有以下几种组合。见表3。2.6.3处理时间的选择3项免疫试验同时改变洗板次数为4、5、6遍,总的处理时间依次为162、138、166min,因此,选择洗涤5遍,总的处理时间最短。20s的浸泡时间各种情况下总的处理时间最短。2.6.4优化前后fame处理的比较见图5、图6。由两个图可知,图6进板排列比图5比较紧凑,12板完成的时间图6比图5处理速度快。2.7服务器系统污染解决加抗-HCV稀释液以及加HBsAg酶引起整排污染措施见表4。2.8试验对象的连接和试验结果的读取路径2.8.1读取加样条码时读取条码时总看盘所有加样仪器形成条码均存在barcodes中,然后将其共享,当仪器读取加样条码时从其读取,比如样本交接和读板时读取条码(barcodes眏射盘W、S、T、K)。2.8.2最优文件的保存澳斯邦读板软件读板结果存放在Sam_results中,然后将其共享;UNC酶标读板软件结果存放在Sunrise中,然后将其共享;TECAN(BEP)读板软件结果存放在temp中,然后将其共享;伽利略软件读板结果存放在galileo中.检验管理接受结果时从中读取(眏射盘G、I、H、K、X),见表5。2.8.3fame模块在维护栏打开设备预置,在设备设置栏打开设备,新建,加样设备,然后在加样设备名称中输入Testsameple,在条码路径中输入J:\BARCODES保存。定义FAME结果发送。进入OS/2全屏幕系统,输入[c:\]ec:fame\hostcmd\savefile.Cmd,按回车键,输入如下:COPY∪%1%2∪J:\FAMERESULTS\*.TXT;FAM_RTC%2∪0;EXIT(∪为空格)。2.9标准板、单一孔的制作96孔试管架图纸见图7。架子形状为长方体,长、宽、高分别为300mm、200mm、50mm,上下共3层板,均由亚克力板制作,其中上层和中层开等距离96孔,每孔直径为15mm,孔与孔之间的距离为6mm,横排开12孔并刻上1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12的编号,竖排开8孔并刻上A、B、C、D、E、F、G、H的字母,底层不开孔。通过磨边、抛光等多道工序进行加工,亚克力板连接部分用进口无影胶粘合,使用9条不锈钢限位螺栓穿过上中下3个平面进行固定。96孔试管架实物图见图8。2.10应用效果2.10.质控物的检测采用本研究的方法对2006、2007、2008年卫生部临检中心发放的HBsAg、抗-HCV、抗-HIV、抗-TP系列质控物进行检验,本室测定的结果与临检中心的靶值符合率为100%,这说明使用全自动检验既没漏检,也没出现假阳性,特异性和灵敏度均达到了要求。2.10.全自动加样和酶免分析以本中心为例,每天处理标本一般在800份左右,常规手工检测抗-TP、HBsAg、抗-HCV、抗-HIV1/2四项须16名工作人员,而应用全自动加样和酶免分析系统仅须6人即可完成。800个标本人工扫条码进行交接需30min,而自动交接标本条码在1min之内完成。3将血样品纳入到微孔的范围,加样针加样和序列的编辑粘稠的液体分配问题。当用STAR全自动加样器采用常规的液体模式加高粘稠度的稀释液时,加样钢针在分配液体过程中往下掉液体。解决此问题,首先将粘稠的液体从冰箱拿出后室温平衡2h,以降低液体的粘稠度,然后对液体的参数进行修改,修改的关键参数是分配液体的速度、分配传输空气体积、吹吸空气体积。若分配液体的速度小于200μl/s,可造成分配的液体呈滴不成线,导致针头易挂液滴,若分配速度大于400μl/s,虽分配的液体成线,但由于惯性的作用导致往下掉液滴,因此,需选合适的分配的速度(300μl/s),当分配速度选择后,针头仍挂少许液滴,此时可设置适量的分配传输空气体积,在分配步骤每次结束后,再吸取1段空气(15μl)、基本将针头的液滴收回。吹吸空气体积可设置为0μl,因STAR加样针在活塞和液体表面之间有1段固定的空气间隔,避免了活塞接触液体可能造成的标本污染,若吹吸空气体积再增加,活塞和液体之间的空气间隔过大,针内的液体由于重力的作用易导致部分液体逸出。在液体编辑器中设置了前舍后弃的功能,舍去前部液体体积为50μl,弃掉后部液体体积为30μl,因此,吸液时的传输空气体积和预湿体积再设置已没什么意义。针尖挂液体问题。解决STAR分配血样品针尖挂液体的关键点是,分配血样品时针尖在离开微板的一瞬间,血样品既要接触微孔底部(或微板内的稀释液)又要接触针头,血样品与底部接触面积大于针尖,有利于增加其黏附力,将血样品留在微孔内,针尖不会挂液体,因此,需要定位加样尖位置,使其距微孔的底部适当位置,当针尖距微孔底部小于1mm或大于6mm,均出现挂液体。50、100μl液体在微孔底部形成的高度依次为2、4mm,因此,当向空微板孔内加血样品量依次为50、100μl时,针尖距微孔底部的高度调整为2、4mm,而抗-HCV由于预先加有100μl的稀释液,虽然加样量为10μl,针尖距微孔底部的高度也调整为4mm。将分配过程中液面跟随设置由开(on)改为关(off),更有利于血样品同时与针头和微孔底部接触的要求。为使分配后的血样品无气泡产生,在液体编辑时,传输空气体积均设为0μl,吹吸空气体积设置为20μl。调整高度以STAR微板载架上平面为参考位置,不同的微板孔底的厚度以及孔直径大小不同,针尖离孔底的距离需根据实际进行调整。双孔分配再检标本问题。在Excel工作表中对再检样本信息进行编辑,并通过仪器软件的自动读取,解决了手工操作存在的问题。编辑此程序需要计算机C++语言,主要用到的语句有文件的打开、设置、读取、关闭语句,循环、条件、序列语句,追踪语句等。难点在于再检样本位置的确定及序列编辑。不等距离阴阳对照加样问题。通过改进,实现了加样针不等距离吸入和分配不同量的液体,可使仪器各加样针得到充分利用,解决了加样针单针分配及多针分配必须吸入和分配相同量的液体的缺点,提高工作效率。该法的关键是序列的编辑,序列定义了工作平台上容器架中容器的加样顺序。STAR钢针拖带污染问题。由于目前全自动加样器采用的是可反复使用的钢针,作为加样针头,虽然针头内外涂有钛氟隆可减少残存样品量,同时加完样品后进行冲洗针头,但残留的样品量不是零,残留的样品量STAR小于10-6,一般情况下大多数样品还是能避免上下孔之间的污染,但若遇到含高浓度抗原、抗体的标本,这种污染是存在的。减少拖带污染的一般方法。对STAR钢针冲洗模式进行调整,适当增加冲洗速度以及冲洗、浸泡和排干时间,但增加的太多会延长整个加样时间;调整STAR前舍后弃参数,加样标本的后弃量由原来的20μl改为5μl,这样可使残留在加样钢针中的标本量在洗涤前降到最低水平;对加样钢针针头进行周维护用50℃的热水冲洗。加酶引起HBsAg拖带污染问题。STAR连续分配液体采用聪明步骤,表面部分分配。向酶标板中进行表面分配时,需定义加样尖的高度,默认的高度是2mm,通过液面感应,加样过程中加样尖随液面的上升而上升。但分配HBsAg酶结合物时,连续加酶过程中针外壁接触到强阳性标本导致后边整排污染,解决办法,改变分配参数,将STAR加酶加样针尖距板底的高度由原来的2mm改为13mm,同时取消液面感应。加稀释液引起抗-HCV整排污染问题。抗-HCV出现整排污染的原因是,前1次加样钢针被污染后,继续加下1板抗-HCV的稀释液,该钢针内残留的阳性标本污染了稀释液导致整排污染。解决办法,改变加样顺序,加抗-HCV的稀释液是第1组针,因此,在加稀释液前至少将1组针有意安排多冲洗几次。编程:整板加完的样品后冲洗(1次),1、2、3组加所有的阴阳对照后冲洗(2次),1组针安排加HBsAg的酶后冲洗(3次),然后1组加下1板抗-HCV(科华)质控提取1根针加稀释液后冲洗(4次),2组加抗-TP工作液,1组加抗-HCV样品稀释液,然后按2、3、1组提针开始加样,通过4次的冲洗,钢针内污染的强阳性标本基本冲洗干净,大大降低了上1板针内样品污染下1板的整排问题。缩短FAME总处理时间的问题。影响FAME总的处理时间的因素有:进板的顺序;板与板之间的时间间隔的设置;试剂及洗涤液的指定位置;洗板次数及洗板浸泡时间;不同厂家试剂不同项目的孵育时间;前处理的加样顺序