抗磷脂抗体综合征患者血清中识别纤溶酶、抗凝血酶和活性蛋白c的检测

抗磷脂抗体综合征患者血清中识别纤溶酶、抗凝血酶和活性蛋白c的检测

抗磷脂抗体（apl）是抗磷脂抗体综合征（aps）的重要血清学特征。临床研究表明，aPL与APS的临床表现如反复的动、静脉血栓、多发性流产、血小板减少症等症状相关。近年我们及其他研究者的研究结果表明，aPL是一组异质性自身抗体，而不是单一的自身抗体,其所针对的靶抗原可为磷脂、纤溶酶/纤溶酶原、β2GP1(β2-glycoprotein1，β2糖蛋白1)、凝血酶/凝血酶原和蛋白C(activateproteinc,APC)等凝血过程相关因子。基于aPL与凝血酶和纤溶酶的亲和力要高于aPL与凝血酶原和纤溶酶原的亲和力,本研究建立了抗纤溶酶、凝血酶和活性蛋白的检测方法并初步探讨其临床意义。材料和方法一、诊断及鉴别标准血清标本来自门诊及住院患者。共选择了40例APS患者血清,其中原发性APS9例，继发性APS31例,包括28例系统性红斑狼疮（SLE),2例干燥综合征，1例狼疮样疾病。SLE的诊断符合美国风湿病学会1982年制订的SLE分类的修订标准。APS的诊断参照有关标准。血栓的诊断依据相关的临床表现及血管造影、CT、MRI等检查。与研究组年龄与性别相匹配的40份健康人血清作为对照组。二、单克隆抗体hrp-羊抗人igg纤溶酶（heamatologicaltechnologies,EssexjunctionVT）溶于PBS5μg/ml,50μl/孔包被反应板(highbindingplates,Costar,Cambrige),4℃过夜,用含0.25%明胶的PBS缓冲液封闭37℃1.5h,pH7.4PBS洗板,2min/次×3,加入1∶300稀释的待检血清（用含0.1%明胶PBS缓冲液稀释）,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,分别加入稀释的酶标抗体HRP-羊抗人IgG,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,加入底物TMB显色,450nm测A值。用人单克隆抗体IS61μg/ml为阳性对照。阳性结果判定:当样品的A值大于阴性对照均值加3s以上时为阳性。三、酶标抗体的筛选凝血酶（heamatologicaltechnologies,EssexjunctionVT）溶于PBS5μg/ml,50μl/孔包被反应板，4℃过夜,用含0.25%明胶的PBS缓冲液封闭37℃1.5h,pH7.4PBS洗板,2min/次×3,加入1∶100稀释的待检血清（用含0.1%明胶的PBS缓冲液稀释）,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,分别加入稀释的酶标抗体HRP-羊抗人IgG,37℃1h后,PBS洗板,2min/次×3,加入底物TMB显色,450nm测A值。用人单克隆抗体IS61μg/ml作为阳性对照。阳性结果判定:当样品的A值大于阴性对照均值加3s以上时为阳性。四、抗apc抗体试验结果一、aps组与p7例抗体检测结果比较APS组和对照组血清抗纤溶酶抗体的检测结果见图1，两组样本抗体检测结果的A值经检验差异有显著性（P<0.01,t检验），如以对照组A值的均值+3s为标准，APS组有17例阳性（17/40,42.5%）。二、aps组与对照组a值及其他指标检测结果比较APS组和对照组血清的抗凝血酶抗体的检测结果见图2，两组样本检测结果的A值经检验差异有显著性（P<0.01,t检验），如以对照组A值的均值+3s为标准，APS组14例阳性（14/40,35%）。三、抗apc抗体测定APS组和对照组血清的抗APC抗体的检测结果见图3，两组样本检测结果的A值经检验差异无显著性（P>0.05,t检验）。aps患者血清中抗凝血酶的活性变化临床检测aPL的方法有抗心磷脂抗体(anticardiolipinantibody,aCL)ELISA检测法和狼疮抗凝因子等方法,其中以aCL-ELISA方法最常用,且已标准化。常规aCL-ELISA法所检测的抗体可能包括:(1)直接与心磷脂结合的抗体,其与感染有关,称之为不依赖于β2GP1的aCL(β2GP1-independentaCL);(2)针对β2GP1的抗体,称为β2GP1依赖性aCL(β2GP1-dependentaCL);(3)近年来发现aCL可识别与磷脂结合的其他血浆蛋白(phospholipid-bindingprotein),如凝血酶原、蛋白S、蛋白C等。我们用EB病毒转化APS患者外周血淋巴细胞，筛选出8株人单克隆aCL，其中6株可同时识别凝血酶/凝血酶原、纤溶酶/纤溶酶原、APC/蛋白C和β2GP1。此研究结果表明这些抗原间存在共同抗原表位，对这些抗原的氨基酸序列和3D结构的分析亦支持上述结论。另外，aCL与纤溶酶的亲和力可达3×108M,高于aCL与纤溶酶原的亲和力约103M。体外实验证明，aCL可抑制纤溶酶对纤维蛋白的降解作用而促进血栓形成。同样，aCL与抗凝血酶的亲和力亦高于其与凝血酶原的亲和力。aCL体外可通过抑制抗凝血酶酶Ⅲ对凝血酶的灭活而促进血栓形成。另外，aCL体外可抑制蛋白C的负反馈调节途径。所以从理论上可推测，检测患者抗凝血酶、抗纤溶酶和抗APC自身抗体可能比检测抗凝血酶原、抗纤溶酶原和抗PC自身抗体有更高的临床价值。为研究APS患者血清中是否存在抗凝血酶、抗纤溶酶和抗APC自身抗体，本研究建立了相应的检测方法，检测40例APS和40名正常健康者对照血清。从图1可以看出，两组样本抗纤溶酶抗体检测结果的A值经检验差异有显著性，如以对照组A值的均值+3s为标准，APS组有17例抗纤溶酶抗体阳性（17/40,42.5%）,而对照组均为阴性。从图2可以看出，两组样本抗凝血酶抗体的检测结果的A值经检验亦差异有显著性，如以对照组A值的均值+3s为标准，APS组有14例抗凝血酶抗体阳性（14/40,35%）。而40名对照组样本均为阴性。从图3可以看出，两组样本抗APC抗体检测结果的A值经检验差异无显著性，表明APS和正常组血清均存在抗APC抗体。我们的初步研究结果表明，APS患者的血清中存在抗凝血酶、抗纤溶酶和抗APC自身抗体，验证了先前aCL单抗的研究结果。但有关这些自身抗体的特异性及其对患者发生血栓的预测价值有待进一步研究。另外，从aPL对凝血系统影响的体外研究结果推测，仅有一部分aPL具致病性(如CL15样的aPL，可同时与凝血酶、纤溶酶和蛋白C结合，并可抑制其功能)。所以建立能检测CL15样aPL的方法并研究其临床意义将是今后的重要课题。APC(heamatologicaltechnologies,Essexjunc-tionVT)5μg/ml溶于TBS缓冲液（20nmol/LTrisHcl,150nmol/LNaCl,2.5nmol/LCaCl2,pH7.4,),50μl/孔包被反应板，4℃过夜,用含0.3%明胶的TBS缓冲液封闭37℃2h,TBS洗板,2min/次×3,加入1∶100稀释的待检血清（用含0.1%明胶的