葡萄糖生物传感器的研究进展

葡萄糖生物传感器的研究进展

网络艺术5内固定和外包1基于生物活性物质的传感器葡萄糖电压计使用固定在电极表面的葡萄糖氧化酶（go）作为识别元件，测量电压并确定葡萄糖浓度。葡萄糖传感器是生物传感器中研究最多的酶电极传感器,它可以简单并迅速地测定血糖,对糖尿病的诊断和治疗有着重要的实际意义。GOD一般都易溶于水,为防止其从电极上脱落流失影响传感器的灵敏度、稳定性、使用寿命等性能,自1962年Clark和Lyons首先报道了基于生物传感技术的电化学GOD生物传感器以来,人们一直在寻找良好的固定生物活性物质的材料。纳米材料由于具有比表面积大和吸附能力强等特点,能够很牢固地吸附酶等生物大分子,并且人们发现,蛋白质等生物活性物质吸附在纳米材料表面仍能保持其活性。因此,近年来人们做了许多探索研究,将各种纳米材料引入生物电化学传感器中以改善传感器的响应性能。2零纳米葡萄糖传感器作为人们研究得最为广泛的纳米材料,零维纳米材料广泛应用于葡萄糖传感器中。2.1金纳米颗粒固载go的传感器金纳米颗粒在葡萄糖传感器领域的应用最为广泛,具有以下几个特点:(1)良好的生物相容性,对生物分子、细胞以及组织等无毒性;(2)金与带有巯基的分子之间能够在温和的条件下形成稳定的金硫键,这种分子可以是有机小分子,也可以是生物分子,因此很容易实现金纳米颗粒的修饰;(3)金纳米颗粒的制备方法简单,其形貌和尺寸易于调控。由于蛋白质等物质吸附在金纳米颗粒的表面仍能保持其生物活性,因此近年来人们做了许多探索,将纳米颗粒引入生物电化学传感器中以改善传感器的响应性能。Crumbliss等通过电沉积将粒径为50nm的金纳米颗粒与GOD电固定在铂丝电极上制成GOD传感器。将该传感器置于4℃的缓冲溶液中两周后测试发现传感器仍保持了80%的生物活性,7周后传感器的活性基本保持在70%不变。Yabuki等通过吸附作用将GOD固定到金纳米颗粒上,并将其修饰于玻碳电极,制得的GOD传感器在0.9V(vsAg/AgCl电极)对葡萄糖有响应,响应时间小于30s,线性检测范围为0.05—1mM。Bharathi和Wang等把溶胶-凝胶技术用于金纳米颗粒固载GOD,制备的GOD电极表现出较好的稳定性以及对葡萄糖较宽的响应范围。在国内,江龙教授研究组早在80年代中期就开始将纳米颗粒引入GOD生物传感器的研究工作。他们将10—30nm的金纳米颗粒用于制备GOD传感器,并发现金纳米颗粒的加入使酶的活性增强,并且10nm金纳米颗粒吸附酶制成的传感器的灵敏度大大高于30nm金纳米颗粒制成的传感器,这主要归因于金纳米颗粒的量子尺寸效应和表面效应。GOD的蛋白质外壳都是电绝缘的,由于具有这种绝缘性,蛋白质外壳和电活性中心很难被氧化或还原。为了能够将电活性中心氧化或还原,实现直接电子转移,人们引入了电子媒介体(在电极和溶液之间充当电子媒介体)。最近,人们发现,在纳米颗粒的促进下直接电子转移也可以发生,而不需要额外的添加电子媒介体。纳米颗粒对于电极的表面修饰将给氧化还原的蛋白质提供一个类似自然系统的微环境,并给出了蛋白质分子更多的识别自由度,从而通过纳米颗粒的导电通道减少蛋白质壳对于直接电子转移的绝缘效应。如果纳米颗粒-GOD通过简单的自组装方法实现共轭连接,那么就可以得到基于纳米颗粒的第三代GOD传感器。Willner小组在这方面做了较多研究,通过将含有55个原子的金纳米团簇用N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxysuccinimide,NHS)功能化,然后将其用腺嘌呤二核苷酸辅酶(FAD)修饰,接着通过不同的双巯基物质,将FAD-Au与金电极连接,这时,再将已经去除了FAD的GOD与上述电极作用,可以在电极表面形成催化活性良好的完整GOD(图1)。重建的GOD的氧化还原中心与金颗粒紧密结合在一起,而金颗粒则充当了电极与这些活化了的具有生物电催化性能的酶的电子转移导线。近年来,由于金纳米颗粒优良的生物相容性以及在电极表面呈现出的优异的介导能力,人们发展出一系列精巧的设计方案,构建基于金纳米颗粒和GOD的各种葡萄糖生物传感器。Sun等通过二巯基化合物连接金纳米颗粒和金电极,利用色氨酸连接金纳米颗粒和被高碘酸氧化的GOD,发展了GOD在金纳米颗粒表面的共价固定方案,对葡萄糖的检出限达到8.2μM。基于层层组装技术(layer-bylayer,LBL),Yang等通过2-巯基乙胺层层连接金纳米颗粒和被高碘酸氧化的GOD,构建的传感器对葡萄糖的检出限达到8μM(图2);南京大学鞠ue40a先教授课题组将GOD直接滴在碳糊和金纳米颗粒的混合物上,制备出的传感器具有简便的突出优点;陈洪渊教授课题组通过高电位导致壳聚糖沉积的方案将金纳米颗粒和GOD一起沉积在金电极上制备出葡萄糖电化学传感器。Huang等将金纳米正八面体通过1,6-己二硫醇连接到金电极表面,再将GOD滴涂到修饰的电极上,最后用琼脂糖稳定,制备的葡萄糖传感器具有很好的灵敏度及稳定性。同时他们发现,随着修饰金纳米正八面体量的增加,电极表面粗糙度也会增加,由于扩大了比表面积,因此电极对葡萄糖的响应电流也随之增加。2.2ag纳米颗粒作为固酶基质的修饰银纳米颗粒同样表现出极强的物理吸附能力,能够吸附包括GOD在内的具有生物活性的蛋白质大分子;同时作为导电性最好的金属,Ag纳米颗粒能够在传感器中充当反应中心和电极之间的导线;另外,Ag纳米颗粒对GOD氧化葡萄糖之后产生的副产物过氧化氢具有优良的催化能力。上述这些Ag纳米颗粒的特殊性质为生物大分子固定同时又能够保持其生物活性提供了一个合适的微环境,也为固定的生物大分子与电极基质之间的电子转移提供了便利。因此,Ag纳米颗粒是一种构建各种类型的生物传感器、提高生物传感器性能的优良材料。作为一种导电性能优良的金属,如果将银制成纳米颗粒应该对GOD有很好的促进作用。然而,一直以来Ag都作为杀菌消毒剂,极低浓度的Ag+就对GOD有抑制作用,而在制备Ag纳米颗粒的过程中,Ag+不能完全被消耗,所以新制备的Ag纳米颗粒不仅不能直接用于修饰GOD,反而会抑制GOD的活性。江龙教授课题组使用不同放置时间的新制备的Ag纳米颗粒对GOD进行修饰,并用戊二醛进行交联,最后用壳聚糖固定(图3所示)。研究表明,放置时间小于30h的Ag纳米颗粒对GOD有抑制作用,而放置时间大于30h时,Ag纳米颗粒有很好的促进作用,并在150h时达到最大。这说明,单纯的银纳米颗粒具有良好的生物相容性。唐芳琼教授课题组将超细Ag纳米颗粒作为固酶基质应用于GOD生物传感器的制备,以改善酶电极电流响应性能。在其他固酶条件相同的情况下,加入Ag纳米颗粒后的酶电极响应电流提高了约40倍。其他小组对Ag纳米颗粒GOD生物传感器也进行了一些研究。袁若教授课题组将稳定的聚亚甲基蓝膜通过循环伏安电聚合到玻碳电极上,并将GOD吸附到Ag纳米颗粒上,用聚乙烯醇缩丁醛作为酶辅助固定剂将其固定到PMB/GC电极上。得到的葡萄糖传感器具有较短的响应时间、较高的灵敏度以及较好的稳定性。葡萄糖的线性范围2.5—2000μM,检出限1.0μM。该传感器具有很低的工作电压从而可以有效排除尿酸和抗坏血酸的干扰。Lan等使用修饰有Ag纳米颗粒掺杂的硅胶-凝胶将GOD固定到通过普鲁士蓝修饰的丝网印刷电极上(图4)。该电极对葡萄糖的线性检出范围为12.5μM—2.56mM,检测灵敏度为20.09m·M-1·cm-2。被固定的GOD储存30天后,仍能维持原活性的91%。2.3sio和au复合纳米颗粒唐方琼教授课题组利用Cu纳米颗粒作固酶基质,发现Cu纳米颗粒也可大幅度提高固定化酶的催化活性,使酶电极的响应电流从相应浓度的几十纳安增强到几千纳安。江龙教授课题组研究发现,将憎水纳米SiO2作为固酶材料可以保持GOD的活性,延长酶电极的寿命。他们将SiO2和Au组成的复合纳米颗粒用于固载GOD,构建GOD生物传感器。实验结果证明,其效果明显优于这两种纳米颗粒单独使用时对GOD电极响应性能的增强作用。除上述纳米材料以外,铂纳米颗粒也因具有对H2O2特殊的电催化能力而广泛用于葡萄糖传感器的制备。零维纳米材料覆盖在电极表面,其大的比表面积使得电极的有效面积大大增加,从而可以显著增强传感器的灵敏度,获得极低的检出限。31纳米纳米颗粒近年来一维纳米材料(如纳米线、纳米管等)应用于GOD传感器的研究越来越多[35—37]。3.1葡萄糖的检测Zhang等通过氧化铝模板法制备了多孔的和实心的金纳米线,并比较了两者在修饰GOD后对葡萄糖的检测能力。实验表明,多孔金纳米线具有与GOD更好的结合能力和对H2O2更好的催化能力,由此制得的第一代GOD传感器只需要5s的响应时间,而线性范围在50μM—20mM,相关系数为0.99906,检出限为46μM。同时,在低电势下,可以排除尿酸和抗坏血酸等影响,通过检测GOD催化葡萄糖的产物H2O2来实现检测葡萄糖的目的。Wang等制备了长20μm、直径为200nm的金镍纳米线。这种纳米线具有磁性,可由外界的磁铁控制纳米线的方位(图5所示)。在纳米线金端修饰上GOD,通过磁铁控制纳米线与表面修饰有二茂铁衍生物的金电极接触的方式,发现平躺情况下得到最大的相应电流。此法实现了对葡萄糖测量的可控性,通过外界的宏观操作就可调节葡萄糖测量的方式,具有操作简单、重现性好等优点,并且能够达到很好的检出限和线性范围。俞汝勤教授课题组利用聚碳酸酯膜,通过电沉积法制备金纳米线(图6)。在玻碳电极表面滴涂壳聚糖,水分挥发后,滴上金纳米线和GOD孵化过夜的混合物,制备出葡萄糖传感器。由于金纳米线具有良好的催化能力、电性能和导电性,因此制得的传感器对H2O2有很好的检测能力,对葡萄糖的检测限达到5μM,并具有很好的重现性,30天后仍能保持初始电流的80%。唐芳琼教授课题组将GOD与金纳米棒的混合物滴涂在铂电极上,再用戊二醛交联,最后使用混有金纳米棒的醋酸纤维素固定。此法可以不需要电子媒介体直接对葡萄糖进行检测。该传感器对葡萄糖浓度具有很好的线性电流关系,并具有很好的重现性,一个月后仍能保持初始电流的80%。Hrapovic等通过电化学刻蚀和电化学共沉淀固定化酶,制备了单根纳米铂丝生物传感器,在对葡萄糖含量的检测中背景电流低于1×10-12A,响应时间仅为2s,检测下限达到20μM。3.2葡萄糖生物传感器Azamian等将CNT修饰电极浸入GOD溶液中,利用偶联剂EDC将CNT和GOD连接,成功将GOD固定在单壁碳纳米管(SWNTs)上(图7,有GOD覆盖的SWNTs要明显粗于未覆盖的),制得GOD-SWNTs复合电极。结果发现,对相同葡萄糖浓度,GOD-SWNTs玻碳电极的催化响应电流是GOD玻碳电极的十倍以上。这表明CNT不仅能够负载足够多的GOD,而且对电子的传递能力也非常强。Tsai等将Nafion、MWCNT、GOD制成薄膜并修饰在玻碳电极上,制得一种复合膜GOD传感器,他们系统研究了该传感器的理化性质与葡萄糖传感增强效果。Lin等通过化学处理CNT表面得到—COOH末端,并将—COOH用活化剂活化与GOD的—NH2反应将GOD固定在CNT表面,制备了GOD传感器(图8)。Joshi等将具有氧化还原性质的含元素锇(Os)的聚合物、GOD与SWNTs组成的复合物修饰电极,制备了葡萄糖的电化学传感器,SWNTs和Os聚合物的加入对传感效果具有明显的增强效应。Kim等将CNT用浓硫酸/浓硝酸处理,活化羧基后,连接通过戊二醛交联的GOD,制成一种可以随意涂覆到各种工作电极上的酶料涂层,得到的GOD传感器能够保持响应电流不变达200天。该涂层还可以应用到对生物材料寿命要求较高的生物燃料电池等领域。Zhang等通过将CNT分散到壳聚糖溶液中,得到了一个具有良好生物相容性的制备生物传感器的平台。Liu等在上述体系中固定GOD,观察到了酶和电极之间直接电子转移的证据,得到了性能优良的第三代GOD传感器。Hrapovic等将CNT与直径为2—3nm的铂纳米颗粒复合并将该复合物分散到Nafion溶液中,再修饰于玻碳电极上,制备了GOD传感器。这种传感器对葡萄糖具有极高的响应速度和灵敏度,在0.15μM—5mM浓度范围内具有线性响应关系,相关系数高达0.998,灵敏度高达2111μA·mM-1,检出限0.15μM。Zeng等通过多氨基枝状化合物(dendrimer)修饰MWCNT,制备了高效的葡萄糖生物传感器(图9)。该课题组还把亚铁氰化钴与CNT和壳聚糖组装起来,利用CNT极佳的电子转移能力,大大提高了亚铁氰化钴的氧化还原活性,制得的葡萄糖生物传感器可以在-0.12V(vsSCE)电压下工作,避免了溶液中电活性物质的干扰。Manesh等采用静电纺丝的方法,把包裹了MWCNT的聚阳离子电解质(PDDA)和聚甲基丙烯酸甲酯制成纳米纤维膜,在膜上固定GOD得到了一种新型的葡萄糖传感器,具有很宽的线性范围和良好的选择性、稳定性及重复使用性能。段大雪等借助CNT以及铂纳米颗粒制备了检测葡萄糖的生物传感器,该传感器稳定性好、响应速度快。毛兰群教授研究组将甲基咪唑通过环氧乙烷聚合到羧基化的CNT上,并将其滴涂在玻碳电极上,然后将电极浸入铁氰化钾溶液,利用甲基咪唑盐所带的正电吸附带负电的Fe(CN)63-,最后将GOD和BSA的混合物覆盖在电极上,得到的葡萄糖传感器线性范围为0.05—0.5mM,检出限达到了0.01mM(S/N=3)(图10)。一维纳米材料的特殊形貌为GOD传感器的设计提供了很多便利,并由此出现了许多新型的GOD传感器。另外,由于碳材料的特性,在CNT材料表面进行化学修饰变得非常容易,因此将GOD直接与CNT进行共价键连接使得固酶效果和传感性能都得到显著提高。再者,CNT作为一种碳材料,具有良好的生物相容性,与细胞直接接触不会产生毒性,用CNT修饰的GOD传感器往往能够大幅提高传感器的重现性和寿命。4金属银纳米颗粒修饰的葡萄糖传感器二维纳米材料具有其自身特殊的物理与化学特性,因此在生物传感器设计的过程中被广泛使用。近年来石墨烯在传感器中的应用受到了人们的关注。Shan等通过离子液体功能化将石墨烯应用于葡萄糖传感器,该传感器表现出很宽的线性范围(2—14mM,R=0.994)、良好的重现性(在-0.5V条件下对6mM葡萄糖进行10次连续测量可以得到3.2%的相关系数)以及非常好的稳定性(一周以后电流响应保持在95%)。Lu等利用Nafion固定鳞片状石墨纳米片,并将GOD修饰于其上,得到的葡萄糖传感器具有高灵敏度(14.17μA·mM-1·cm-2)、较短的响应时间(5s)以及极低的检测限(10μM)和宽的线性监测范围(~6mM)。他们将Pt和Pd纳米颗粒修饰于鳞片状石墨纳米片上,并用Nafion固定纳米颗粒和纳米片,再修饰GOD,得到的葡萄糖传感器各项性能得到很好的改善:检测灵敏度61.5μA·mM-1·cm-2,响应快速(2s),检出限1μM。由于鳞片状石墨纳米片简单易得,所以它是一种很好又很经济的制备葡萄糖传感器的材料。我们课题组通过将三角形银纳米颗粒(AgTNPs)与壳聚糖和GOD进行混合,用戊二醛进行交联以防止GOD泄漏,并将该混合物蘸涂到铂电极上,在空气中风干,制备出的传感器对葡萄糖具有高灵敏性(67.17μA·cm-2m·M-1),宽线性检出范围(3μM—3mM),低检出限(1μM)。在该传感器中,AgTNPs对检测性能的改善起到了决定性作用(如图11—13)。AgTNPs具有良好的生物相容性,因此GOD吸附在AgTNPs表面,仍能够很好地保持活性(图11)。同时由于具有高导电能力,因此AgTNPs还能够促进GOD与电极表面的电子转移。另外,Ag纳米颗粒对H2O2有催化能力,在该传感器中也得到了体现:与不含AgTNP