影响酶联免疫吸附试验结果的因素及控制方法

影响酶联免疫吸附试验结果的因素及控制方法

酶联免疫吸附试验是一种酶联免疫技术，用于检测被固相板孔包围的选定抗体（或抗体）。这是酶免疫研究中应用最广泛的技术。在酶联免疫吸附试验具体操作中,由于诸多注意事项,试剂、样本等可控因素可直接影响试验结果的准确度,操作中各个环节的错误,均会导致异常结果的产生,进而影响临床对患者病情的把握。现将影响酶联免疫吸附试验结果的可控因素及控制方法报告如下。1可控制因素1.1样品的采集和选择1.1.1血红蛋白浓度过高时,以辣根过氧化物酶为氧化物的免疫吸附试验所采集标本血红蛋白中含有类过氧化物酶活性的成分(含铁血红素),故在血红蛋白浓度过高时,以辣根过氧化物酶为标志物的酶联免疫吸附试验易出现辣根过氧化物酶的反应显色,进而造成检测结果的假阳性,故严禁使用溶血标本进行试验。1.1.2凝固时间的测定在酶联免疫吸附试验中,为了节省时间对标本进行检测试验,造成标本的凝固不完全(血液的正常凝固时间为:采血0.5～2h后开始凝固,18～24h完全凝固)。由于标本未凝固完全,故在测定过程中,会看到血清中的残留纤维蛋白原,进而造成假阳性结果的产生。故在标本采集过程中要注意时间的把握和促凝剂的选取。1.1.3酶联免疫吸附试验目前由于生化和免疫标本的混用,且标本中本身含有指示剂辣根过氧化物酶,均会造成酶联免疫吸附试验中非特异性的不正常显色现象。故在采集标本及检测过程中应选取无菌试管,尽量将生化和免疫使用的试管分开,防止标本污染。1.1.4长期保存,注意使用时间在待检标本的保存过程中,时间不能过长,对于采集的标本如未立即使用,应采取合理保存方法。长时间保存,会导致标本底色加深,造成检测中假阳性结果的产生。故在标本选择过程中,最好选择新鲜标本,尽量缩短保存时间。1.2试剂的选择和使用1.2.1检测力度不同国内不同试剂生产厂家对于试剂质量的把关检测力度有所差别。在试剂的选择过程中,一定要选择具有“三证”的知名厂家购买试剂。切忌使用过期试剂进行试验检测。1.2.2试剂使用的准备在使用过程中,对于取用试剂的操作准备常常不够充分。正确的试剂使用准备方法是:从冰箱中取出试剂,在室温下放置20～30min,以使试剂恢复到放入冰箱前的温度,避免假阳性结果的产生。1.3操作中的可控制单元1.3.1微量加样和阳性对照的使用在酶联免疫吸附试验中,标本检测会有3次基础加样(先加入样本,再加入酶结合物,最后加入底物),标本的加入使用微量加样器,在加样过程中,要注意加样时间不能太长,不要把样本滴在孔外,且滴完一个孔,要换移液头,以避免标本的交叉感染。在加样过程中,不能产生气泡,在阴性对照和阳性对照加入的过程中,要注意与试剂相对应。标本较多时,应进行分批操作,避免加样时间过长而导致假阳性结果的产生。1.3.2易出现问题的步骤温育是酶联免疫吸附试验中最为复杂、操作注意事项最多的一个步骤,同样也是最容易出现问题的一个步骤。在温育过程中应注意:①温育时间的把握,温育过程的计时应将温度计放置在板孔处,以便正确测出温育温度,进而把握好温育时间;②温育温度的检测,必须等孔温从室温上升至37℃时,方可将试剂管放入,并开始计时。1.3.3操作问题产生交叉感在酶联免疫吸附试验中,可选用洗板机或者手工洗板,但是两种方法均存在不足之处。采用洗板机洗板时,由于洗板针堵塞,使得洗板不彻底,清洗不干净;手工洗板,则极有可能由于操作问题产生交叉感染。所以,在操作过程中,如使用洗板机进行洗板,则需检查洗板针的杂物堵塞情况;如采用手工洗板,用力不能过猛,尽量做到板面垂直,防止感染。1.3.4温度和时间的确定在显色与比色操作过程中,切忌将各试剂盒混用。在显色过程中,应严格把握显色时间和显色温度,显色是酶联免疫吸附试验最后一步操作,在定性检测时,显色要在室温下进行,时间可不加以控制,要根据具体情况,缩短或者延长时间。比色过程中,操作者要认真熟悉各项操作,认真观察检测过程中各项结果的产生,并做出合理判别,尽量避免结果的假阳性。2可控影响因素的考察酶联免疫吸附试验以其灵敏度高、操作简便的优点,在传染性疾病、肿瘤标志物的检测中广泛应用。但在操作过程中,常会因试剂、标本及操作等原因,影响正确结果的判读。研究发现,在酶联免疫吸附试验的操作中,操作者必须熟练掌握其基本操作,严格进行试剂、样本的核查,才能确保检查结果的准确性和可靠性。此外,对于实验室室内和室间质量的控制,也是减少