抗甲霜灵辣椒疫霉菌株生物学性状测定及生物学性状分析

抗甲霜灵辣椒疫霉菌株生物学性状测定及生物学性状分析

甲霜灵是一种具有独特植物感染特性的内毒唑酮衍生物，可以保护和治疗。这是预防和治疗植物感染最常用的药物之一。甲霜灵的作用机制主要是通过抑制疫霉菌的RNA聚合酶Ⅰ的活性,从而抑制疫霉菌RNA的合成。甲霜灵属于特异性位点抑制剂,对病原菌作用位点单一,因此,病原菌易对其产生抗药性,且抗药性的发生速度快、抗性水平较高。甲霜灵对疫霉菌生物学性状的影响较为复杂,前人研究表明,从室内外获得的疫霉菌抗甲霜灵突变株,除抗药性发生变异外,其它生物学性状也可能发生变异。但不同疫霉种或不同研究所得的结果差异较大,如恶疫霉Phytophthoracactorum和大雄疫霉P.megasperma抗甲霜灵突变株的生长速度显著小于野生型亲本,而大雄疫霉苜蓿专化型P.megaspermaf.sp.medicaginis的抗药性菌株生长速度与野生型敏感亲本菌株相似;苎麻疫霉P.boehmeriae抗甲霜灵突变株的生长速率、生长温度范围、游动孢子囊产生量和对棉苗的致病力等性状与其亲本均无显著差异;致病疫霉P.infestans抗甲霜灵菌株产生孢子囊的能力强于野生型敏感亲本。目前,关于甲霜灵对辣椒疫霉P.capsici生物学性状的影响仅国外有少量报道。Bower&Coffey报道抗甲霜灵辣椒疫霉菌株的致病力、孢子囊产生能力和适生性均强于敏感菌株;Bruin&Edington研究认为,抗甲霜灵辣椒疫霉菌株的菌丝生长速率、适生力等较敏感菌株弱;而Café-Filho&Ristaino研究认为,辣椒疫霉抗精甲霜灵(mefenoxam)菌株的菌丝生长速率、孢子囊产生能力、毒力和适生性等与敏感菌株均无差别。国内迄今尚无相关报道。据作者等研究,安徽地区已有一定比例的辣椒疫霉菌株对甲霜灵产生了抗性。然而,这些抗性菌株的生物学特性的变化尚不清楚。为此,本试验对田间自然产生及室内筛选获得的抗甲霜灵辣椒疫霉菌株的菌落形态、产孢能力、生长速率、致病力等生物学性状进行了研究,以期明确甲霜灵对辣椒疫霉生物学性状的影响及辣椒疫霉抗甲霜灵菌株的适生性。1材料和方法1.1菌株的筛选和生产辣椒疫霉P.capsici菌株DS4和YS7分别从安徽砀山县和颍上县的辣椒田间采集分离,对甲霜灵具有抗性,EC50值分别为25.4721μg/mL和12.3905μg/mL;菌株HX2和HN3分别是从安徽省和县和淮南市采集分离的辣椒疫霉菌株,对甲霜灵敏感,EC50值分别为0.2046μg/mL和0.2147μg/mL;菌株HX22和HN31分别是以HX2和HN3菌株为亲本经室内筛选获得的抗甲霜灵突变株,EC50值分别为287.3582μg/mL和376.2863μg/mL。供试孔雀石绿(malachitegreen,C23H25ClN2)由天津市巴斯夫化工有限公司生产;91.2%甲霜灵(metalaxyl)原药,江苏宝灵化工公司生产;辣椒、西葫芦、南瓜、番茄、茄子等果实,市购。1.2方法1.2.1厚垣药物释放率测定菌落形态:供试菌株在CA培养基上25℃黑暗培养3天,从菌落边缘取直径5mm的菌丝块,分别移至空白CA平板和含有5μg/mL甲霜灵的CA平板中央,25℃下黑暗培养5天,观察、记录病原菌菌落、菌丝形态特征;在CA平板上单株培养2周以上,观察是否产生卵孢子;在36℃高温、16℃低温、25℃常温下交替培养各1周,观察是否产生厚垣孢子。试验设3次重复。孢子囊形态及产孢能力:供试菌株在CA平板上25℃黑暗培养4天后,沿菌落边缘取直径5mm菌碟10个于20mL皮氏液中,25℃下光照培养24h。挑取已产生大量孢子囊的菌丝块于试管中,加水1mL,用力摇晃5min,镜检孢子囊脱落情况。随机测量20个孢子囊的大小及乳突高度,计算孢子囊长宽比。吸取孢子囊悬浮液5μL滴于载玻片上,于10×16倍显微镜下镜检,计数孢子囊总数,重复5次。计算平均游动孢子囊数量/mL。取20μL无菌水于载玻片上,挑取少许带游动孢子囊的菌丝在水中分散,于显微镜下随机固定1个视野,每隔10min观察一次孢子囊释放游动孢子情况,计数孢子囊总数和已释放游动孢子的孢子囊数,最后计算孢子囊的释放率,重复5次。参照彭化贤等方法将同期配制的孢子囊悬浮液静置1.5~2h后,取5μL菌液滴于血球计数器上,镜检,计数游动孢子总数和萌发的游动孢子数,计算萌发率。重复5次。1.2.2温度对菌落直径的影响将供试菌株接种于CA平板上,25℃黑暗下培养4天,用直径4mm的打孔器沿菌落边缘打取菌碟,转接到CA平板培养基的中央,分别在8、12、16、20、24、28、32、36、40℃下恒温培养96h,测量菌落直径,每处理3次重复。根据菌丝的生长情况和菌落直径的大小确定菌丝生长的最低、最适和最高温度。1.2.3生长抑制率测定对孔雀石绿的敏感性:从CA培养基上取直径为5mm的供试菌株菌丝块,接种于含孔雀石绿浓度分别为100、10、1.25、1和0.1μg/mL的CA平板中央,以不含孔雀石绿的CA平板为对照,25℃下培养3天,测定菌落直径,计算菌丝生长受抑制程度,每处理3次重复。对淀粉的利用能力测定:采用Ho&Foster含淀粉固体培养法,将供试菌株于25℃下在CA平板上培养,4天后测定菌落直径(D)和淀粉水解圈直径(d),用淀粉水解指数(hydrolysisindex,HI)衡量各菌株利用淀粉的能力。HI(%)=(d/D)×100。1.2.4病原菌的培养将供试菌株分别在CA培养基上培养5天,沿菌落边缘处打取直径为4mm的菌饼。选择新鲜、整齐、健康的辣椒、西葫芦、南瓜、番茄、茄子等果实,用针束(4根小号昆虫针扎在一起)在果实表面轻刺,然后将菌饼反贴于伤口处,再用脱脂棉球蘸水保湿,置于26℃的培养箱内保湿培养,48h后观察各果实发病情况,84h后测量各处理的病斑最大直径。以空白CA培养基块为对照,每处理重复3次。1.3数据的统计分析采用SPSS13.0统计软件对试验数据进行方差分析,采用SSR法进行多重比较。2结果与分析2.1培养特性2.1.1抗甲霜灵突变株与分子鉴定株h2c、hn3的形态特征6个供试菌株在空白CA培养基上培养4天后,菌落白色,HN3、HN31和DS4呈绒毛状,外缘整齐平滑,而HX2、HX22和YS7呈花瓣状或放射状扩展,其中抗甲霜灵突变株HX22和HN31分别与其亲本菌株HX2和HN3形态相似。在含甲霜灵的CA平板上,抗甲霜灵菌株DS4、YS7、HN31和HX22的菌落形态与在空白CA培养基上一致,而对甲霜灵敏感的HN3和HX2菌株在含5μg/mL甲霜灵的CA平板上均不能生长。2.1.2抗甲霜灵菌株的前培养液抗甲霜灵菌株DS4、YS7、HX22和HN31与甲霜灵敏感菌株HX2和HN3所产生的孢子囊形态相似,均为淡褐色,多卵圆形、近球形或长椭圆形,不同菌株的孢子囊大小、柄长和乳突因发育程度不同有明显差异,但平均长39.8~44.8μm、宽28.4~31.7μm,长宽比为1.36~1.47,菌株间差异不明显;孢子囊乳突明显,绝大多数为单乳突,偶见双乳突,乳突高度为2.6~7.4μm,平均为3.9~4.4μm;孢子囊易脱落,孢囊梗形态与菌丝差异不大,长柄,长度为18.6~60.1μm,平均为35.0~38.4μm(表1)。抗甲霜灵菌株DS4、YS7、HX22和HN31与甲霜灵敏感菌株HX2和HN3孢子囊产生量分别为9600、10800、11000、11600、12600和13000个/mL;孢子囊释放率分别为65.9%、68.4%、62.6%、66.6%、64.3%和61.3%;游动孢子萌发率分别为42.1%、40.6%、42.0%、35.3%、38.5%和39.8%。经方差分析,各菌株间孢子囊产生量、孢子囊释放率、游动孢子萌发率等差异均不显著;所有供试菌株单株培养2周后均未发现卵孢子,高温-低温-常温交替培养3周后未发现厚垣孢子。说明抗甲霜灵菌株的产孢能力与甲霜灵敏感菌株相似。2.2生长速率和菌落直径分别测定了不同温度下各菌株生长速率和同一温度下不同菌株生长速率,各菌株在24~28℃下的生长速率均显著快于其它温度,平均达10.8mm/天左右,12~16℃和36℃条件下,各菌株生长速率较慢,显著低于其它温度;同一温度下各菌株的生长速率差异未达显著水平。说明抗甲霜灵菌株DS4、YS7、HX22和HN31的生长速率与甲霜灵敏感菌株HX2和HN3相似(表2)。供试的6个菌株在12~36℃范围内均可生长,其中最适生长温度为24~28℃,在24℃时菌落直径最大,培养4天后平均达47.5mm,28℃条件下菌落直径平均为47.12mm;各菌株在8℃和40℃下均不能生长。表明抗甲霜灵菌株DS4、YS7、HX22和HN31的生长温度范围与甲霜灵敏感菌株HX2和HN3相似。2.3抗甲霜醇免疫球蛋白的生理生化特性2.3.1孔雀石绿假设计供试菌株在含孔雀石绿0.1μg/mL的CA培养基上均能正常生长,抑制率为2.2%~10.0%,在含1.00μg/mL的孔雀石绿CA上仍能生长,且不同菌株的菌落直径间无显著差异。随着孔雀石浓度的增加,各菌落的直径逐渐减小,在1.25μg/mL浓度下,孔雀石绿对各菌株的抑制率为52.6%~72.7%;在10μg/mL浓度下,菌株YS7和HX2分别被抑制94.8%和91.6%,其余4个菌株则完全被抑制;在100μg/mL浓度下各菌株均不能生长。说明抗甲霜灵菌株对孔雀石绿的敏感性与敏感菌株相似(表3)。2.3.2菌株对淀粉的利用能力供试的6个菌株利用淀粉的能力有较大差异,其中菌株HX2、HX22和YS7能够有效地利用淀粉作为碳源,水解指数分别为0.93、0.94和0.95,而菌株DS4、HN3和HN31对淀粉的利用能力较差,水解指数分别为0.30、0.18和0.21。虽然不同菌株对淀粉的利用能力存在差异,但抗甲霜灵菌株HX22和HN31分别与其亲本HX2和HN3的水解指数相近,说明甲霜灵没有改变菌株对淀粉的利用能力。2.4对不同果实的致病力检测用供试菌株分别接种辣椒、西葫芦、南瓜、番茄、茄子等植物果实,3天后被接种果实均产生明显病斑。不同种类果实上的病斑直径相差较大,其中西葫芦上的病斑直径平均达37.78mm,而番茄上仅18.47mm,说明辣椒疫霉对不同种类植物果实的致病力存在差异。进一步对不同菌株在同一种果实上的病斑直径和同一菌株在不同种果实上的病斑直径进行统计分析,不同菌株对同一种蔬菜果实的致病力存在差异,如HX2菌株对辣椒的致病力显著强于YS7、HN3和HN31菌株,而其对南瓜的致病力则显著弱于YS7、DS4、HN3和HN31菌株,且均达极显著水平;同时,同一菌株对不同果实的致病力也存在明显差异,如YS7菌株对南瓜的致病力显著强于对辣椒、番茄和茄子的致病力,而DS4菌株对西葫芦的致病力显著强于对其它4种果实的致病力;HX2与HX22对同一种植物果实的致病力差异始终未达显著水平,HN3与HN31亦然,说明抗甲霜灵菌株HX22和HN31与甲霜灵敏感菌株HX2和HN3的寄主范围和对植物果实的致病力相似(表4)。3主要生物性状及抗性突变株的获得Cafue7b0-Filho&Ristaino研究表明,辣椒疫霉抗精甲霜灵菌株的适生性与敏感菌株无明显差别。虽然使用的是精甲霜灵而非普通的甲霜灵,但精甲霜灵是外消旋体甲霜灵中的一种(R体),具有与普通甲霜灵相同的作用机制,只是活性更高,因此抗精甲霜灵菌株的研究结果同样适用于抗甲霜灵菌株。本研究表明,辣椒疫霉抗甲霜灵突变株的形态特征均与敏感菌株相似,主要生物学性状与敏感菌株均无显著差异,说明其生物学性状未因辣椒疫霉对甲霜灵产生抗性突变而改变。结果与Cafue7b0-Filho&Ristaino的观点相一致。据报道,美国特拉华、马里兰、新泽西、卡罗莱纳以及智利、意大利、中国江西等地辣椒疫霉群体内均检测出一定比例的抗甲霜灵或精甲霜灵菌株。作者等之前研究发现,在施用甲霜灵次数频繁、年限较长的安徽和县、砀山等地区,已经出现抗甲霜灵的辣椒疫霉菌株,例如DS4和YS7。在本研究中,作者以野生型敏感菌株HX2和HN3为亲本,经室内药物筛选分