浅谈酶联免疫吸附试验的技术要求

浅谈酶联免疫吸附试验的技术要求

酶联免疫吸附试验（elisa）是一种常见的固相酶免疫计量法。Engvall和Perlmann于1971年首先应用该法定量测定了IgG。并对这种方法进行命名。ELISA检测法具有简便、快速、灵敏度高、特异性强、操作安全、无污染和成本低等特点。并且适用于大批量人群抗原、抗体筛查,目前在国内实验室尤其是缺乏特殊设备的基层医院被广泛使用。但在临床检验中常可见到一些错误结果(假阳性或假阴性结果)。本文就ELISA检测操作中的技术要求及影响因素进行了分析。1样品处理的影响1.1结果呈假阳性凝固不全的血清中含有部分纤维蛋白原,可使结果呈假阳性。解决这个问题可使用加有抗凝剂而不含分离胶的红色帽采血管;将采集后的血液放入37℃水浴,待充分凝固后再离心分离血清。1.2elisa测定辣根过氧化物酶活性标本离心力过大或离心时间过长都会造成标本溶血。溶血的标本中血红蛋白的含铁血红素有类似氧化物酶的活性,因此,在含有辣根过氧化物酶(HRP)的ELISA测定中,很容易使含铁血红素吸附于固相,从而与加入的HRP底物反应显色。因此在试验中建议选择相对离心力(RCF)为1000g~1200g,离心时间为5~10分钟为宜。1.3血清中igg-igg-gg-g标本在冰箱中保存过久,容易在离心时造成溶血,另外血清中IgG可聚合成多聚体,导致本底过深,甚至造成假阳性。因此,ELISA检测尽量采用新鲜标本,或离心后吸取血清保存。2假阴性的检测很多实验室的试剂从冰箱里拿出来即用。这种做法使试剂在微孔内反应温度太低,反应不充分,容易对一些弱阳性标本的检测出现假阴性。因此,在ELISA测定中试剂准备最为关键的是将试剂盒先从冰箱中拿出来,在室温下放置30min,使反应微孔内及试剂的温度较快地达到试验所需的温度。3样本的额外影响3.1应时间不一致实验样本过多时,加样时间过长使得标本与阳性对照、阴性对照、质控反应时间不一致,从而影响临界值与标本检测OD值的一致性,导致假阳性或假阴性结果出现。解决这个问题可分批次操作,从而缩短同批次的加样时间,使标本与阳性对照、阴性对照、质控反应时间尽量相同,减少误差。3.2滴瓶内进入空气量不准确很多试剂采用滴瓶包装,可以采用滴加方式,方便操作,缩短时间。但滴加的角度不同、挤压的力度不同,甚至滴瓶内进入空气量的多少都可以使滴加的试剂量不准确。而阳性对照、阴性对照与质控常常需要加样器加注,两者量的差别也容易使临界值与标本检测OD值不一致而导致假阳性或假阴性结果。为消除这一影响,建议尽量按照试剂盒说明量使用加样器加注,加样前检查吸头松紧度,用吸头反复吸打几次,并经常校正其准确性。3.3悬液器的操作加注同一种试剂时,常常多孔使用一个吸头,在繁忙的操作中很容易接触孔壁污染吸头,从而污染其他微板孔。这就要求操作者多进行操作,练习悬空加注,掌握正确的操作姿势、手法。持握移液器的肘部在操作台支撑一下,可以增强手部悬空加注的稳定性。另外悬空加注容易产生气泡,会减少试剂接触面积,影响试剂反应。这也需要通过反复练习消除其影响。若微板孔中同时需要加入两种以上试剂时,加入后要混匀,以利于试剂充分反应。4温育4.1根据本底反应程度所起的作用,选择最佳温度和时间。根据试剂盒温育也是ELISA测定容易出现问题的步骤。试剂盒确定的一定温度下的反应时间并不是反应的终点。升高反应温度,会加快反应,同样增加时间会延长反应,这样得到的反应程度会比试剂盒确定的反应程度高,会引起阴性高值或假阳性。所以要严格根据试剂盒的说明书选择温育时间、温度。将微孔板从室温放入水浴箱或温箱中时,孔内温度从室温升至37℃需要一定时间,如果将微孔板一放入温箱即开始计时,容易造成实际温育时间缩短,易致弱阳性标本测不出来。如有备选温度、时间段,尽量使用较低的温度、较长反应时间的条件。4.2周孔显色较中心孔温箱温育时容易产生“边缘效应”,即ELISA测定的96孔板中,外周孔显色较中心孔深的现象。产生的原因可能是为96孔板周围孔与中心孔在温育中的热力学梯度造成的,因此在温育时尽量采用水浴。水浴时注意水的高度要高出试管架少许,使微孔板底部浸入水中,并尽量减少微孔板重叠。4.3温育时尽量覆盖胶贴试剂盒通常设定的反应温度为37℃,这个温度下放置30分钟,微板孔内蒸发的水分会很多,对于整个反应体系来讲,各种反应物的浓度会不断增加,这样必会导致反应最后的值升高,因此温育时最好覆盖胶贴。5洗板ELISA测定的洗板步骤是最主要的关键技术,应引起操作者的高度重视。一般有两种方式,即手工和洗板机洗板。5.1洗涤剂、转色人为因素较大,实验人员必须经验丰富,加入的洗液量以刚满反应孔为限。注液量太少,孔口内有游离酶未能洗净;注液量太多,孔与孔之间液体交叉,容易污染。洗涤结束后扣干亦非常重要,有残留易造成假阳性。拍板时要垂直,避免交叉污染,用力不能过猛,防止抗原抗体复合物脱离。酶结合物不耐干燥,特别在较高的温度下更易失活,所以拍干的反应板应尽量缩短在空气中暴露的时间,时间越长,吸光度值越低。5.2洗板次数的影响人为因素少,速度快,条件恒定,洗液量注入较准确。但是使用洗板机洗板的一个特点是,每次洗板后不能拍干,故有较多的液体残留,需增加洗板次数来减少这种误差。但洗板次数并非越多越好,太多不但浪费人力、物力,并且也会导致假阴性结果。同时需要严密观察,洗液量不足导致洗板不彻底,洗板针堵塞导致抽吸不完全,同样会出现误差。为了洗涤效果好,可采用机器与人工洗涤相结合的方法,在机器洗涤后再进行人工洗板1~2次,能达到理想的洗涤效果。6光孔的选取读板时微板孔中避免存在气泡,以免假阳性结果出现。读板时微板放置应平稳,否则影响与酶标仪透光孔的对齐。读板前还