自体骨髓基质细胞在长期化疗中的造血功能恢复

自体骨髓基质细胞在长期化疗中的造血功能恢复

骨髓基质细胞（bmsc）是血液微环境的重要组成部分，是维持血液供应活动的基本结构。我们观察了长期化疗对基质祖细胞、造血祖细胞的损害;对长期化疗的患者化疗后输注体外扩增的自体BMSC(ABMSC),观察其促进化疗后造血功能恢复的作用,现报告如下。材料和方法1血药学和生化药物碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自美国Chemicon公司,IL-3、GM-CSF购自Sigma公司,G-CSF购自日本中外制药公司,Epo购自日本麒麟公司,胎牛血清(FCS)、马血清(HS)购自中国医学科学院血液学研究所。2化疗方案及疗效正常对照组10名,系健康献髓者,男6名,女4名,平均年龄28岁(15～51岁)。短期化疗组10例,连续接受标准剂量化疗方案2～3个疗程,骨髓象正常者;男6例,女4例,平均年龄32岁(12～64岁),急性髓系白血病(AML)4例,急性淋巴细胞白血病(ALL)4例,非霍奇金淋巴瘤(NHL)2例。长期化疗组10例,均按标准剂量连续化疗6个疗程,骨髓象正常者;男6例,女4例,平均年龄34岁(11～62岁),其中AML2例,ALL4例,NHL4例。3阿糖胞苷、maALL患者采用VDLP(长春新碱、柔红霉素、左旋门冬酰胺酶、泼尼松)、鬼臼噻吩甙+阿糖胞苷、MA(米托蒽醌、阿糖胞苷)方案;AML患者采用DA(柔红霉素、阿糖胞苷)、HA(高三尖杉酯碱、阿糖胞苷)、MA方案;淋巴瘤患者采用CHOP(环磷酰胺、阿霉素、长春新碱、泼尼松)、CMOP(环磷酰胺、米托蒽醌、长春新碱、泼尼松)方案。4长期化疗的abmsc的制备4.1取正常对照者和化疗患者骨髓行CFU-GM、CFU-E、BFU-E、基质细胞集落(CFU-F)培养,基质层观察。化疗患者化疗结束15～18d、骨髓象正常后取髓。粒、红系祖细胞培养采用甲基纤维素法,CFU-F培养在文献报道的基础上有所改动,采用含体积分数为20%FCS、1ng/mlbFGF的IMDM培养液,细胞接种浓度为1×106/ml。CFU-F计数:每皿接种1ml,12～14d计数,40个细胞以上为1个集落。基质层观察:25ml容积的培养瓶接种4ml,倒置显微镜下动态观察其融合程度及完全融合时间。融合程度以覆盖率表示,即瓶表面被基质层覆盖的百分比。4.2长期化疗组患者再次化疗采用与前次相同的方案,化疗结束第2天回输体外扩增的ABMSC,15～18d后取骨髓行CFU-GM、CFU-E、BFU-E、CFU-F培养,观察基质层。4.3观察长期化疗组患者前后两次化疗后血常规变化情况。记录外周血白细胞计数、血小板计数最低值及恢复到正常的时间。5细胞培养液的制备长期化疗组患者化疗结束2～3周,骨髓象恢复时,从髂后上棘多点抽取骨髓约80ml,分离出单个核细胞,按1×106/ml置于含体积分数为20%的FCS、1ng/mlbFGF的IMDM培养液中培养,每周半量换液,2～3周待贴壁细胞完全融合后收集。其中2例按1∶3传代,1周后融合,融合后收集贴壁细胞。6基质细胞回输弃去培养液,细胞用IMDM培养液清洗3遍,置于CO2孵箱中,用IMDM培养液浸泡30min,取出,经2.5g/L胰酶+0.2g/LEDTA消化5min,弯头吸管吹打,收集所有贴壁细胞离心洗涤,过4号针头,计数,放入生理盐水100ml中于化疗结束第2天静点,输前给予地塞米松2mg(壶注),30min输完,回输基质细胞的数量为(1.1～8.7)×108个。输时及输后注意观察患者的症状及体征。7统计分析组间比较采用不配对t检验,输注BMSC组与未输注BMSC组之间采用配对t检验。结果1正常对照组和短期化疗组cfu-gm、bif-e、cfu-f比较长期化疗组CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-F显著低于正常对照组与短期化疗组,正常对照组及短期化疗组CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-F差异无显著性(P>0.05)。基质层覆盖率及完全融合时间三组间差异无显著性(P>0.05)(表1)。2cfu-e、cfu-f输注前后输注时f长期化疗患者输注ABMSC后CFU-GM、BFU-E、CFU-E、CFU-F较未输注时显著升高。输注与未输注ABMSC两者间基质层覆盖率、基质层完全融合时间差异无显著性(P>0.05)(表2)。3化疗前后未输注abmsc时输注abmsc时细胞计数、血小板计数的恢复情况长期化疗组化疗后输注ABMSC者其血常规中白细胞计数及血小板计数降至最低点值明显高于化疗后未输注ABMSC时,白细胞计数、血小板计数恢复至正常的时间也明显缩短(表3)。长期化疗与基质祖细胞重建治疗造血及非造血系统肿瘤采用的标准剂量化疗及大剂量放、化疗可导致短暂或永久性造血和基质祖细胞成分的损害。本实验中,患者接受短期化疗后,并未显示出粒、红系祖细胞及基质祖细胞数的明显减少,说明经短期标准剂量化疗后,患者经过骨髓抑制期,通过造血干/祖细胞增殖、分化,骨髓造血恢复正常;同时基质祖细胞从静止期进入增殖期,通过增殖、分化,使造血微环境恢复正常。而长期化疗患者的粒、红系祖细胞及基质祖细胞数显著低于正常人及短期化疗患者,说明化疗药物的反复毒性作用可对骨髓造血及造血微环境造成明显损害。这种细胞毒药物的累积作用可导致造血微环境、造血功能的长期甚至永久性损害,还可影响到骨髓移植或外周血干细胞移植后的造血重建。在本实验中,我们并未发现长期化疗对基质祖细胞形成基质融合层有影响。说明尽管长期化疗可造成基质祖细胞量的减少,但尚不足以造成基质融合功能的损害。基于此,我们采取体外扩增技术,使基质祖细胞得到大量扩增,于化疗后回输给患者。通过自身前后对比可见,输注体外扩增的ABMSC后较未输注时,粒、红系祖细胞及基质祖细胞显著升高,外周血白细胞、血小板计数降至最低点的值显著升高,白细胞、血小板计数恢复正常的时间明显缩短。说明输注BMSC缩短了骨髓抑制期,促进了造血的恢复。最近,Koc等给予进展期乳腺癌患者大剂量化疗后混输自体外周血干细胞与体外扩增的BMSC,输注的基质细胞量为(1.0～2.2)×106/kg,结果有效地促进了造血恢复,尤其血小板恢复加快。我们培养的BMSC与Koc等培养的BMSC在形态上无差异,均为梭形、多角形成纤维样细胞。经扩增后可密集融合成片,其间仅夹杂很少量圆形细胞,经传代后可获得均一的成纤维样细胞。我们在培养中加用了bFGF,结果显示加bFGF后可显著促进基质祖细胞生长。我们建立的培养体系能在3～4周内产生1.1×108以上的BMSC,明显提高了临床应用价值。收集前