奥沙利铂联合17-aag诱导人结肠癌rko细胞凋亡的研究

奥沙利铂联合17-aag诱导人结肠癌rko细胞凋亡的研究

0hsp293-7-aag抑制剂肠肿瘤是一种常见的神经系统疾病，是由多个因素和突变积累的过程。根据系统生物学的研究，相关信号通道蛋白质的过度表达和异常激活导致其发生、发展和转移。近年来随着含铂方案的应用使得肠癌的治疗效果较前有所提高,但进展期结肠癌的五年生存率仍较低。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格尔德霉素(17-allylamino-17-demethoXYgeldanamycin,17-AAG)是Hsp90(热休克蛋白90)抑制剂。目前研究已发现17-AAG能够诱导乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌等肿瘤细胞凋亡,且能增效阿霉素等化疗药物疗效的作用,但其确切分子机制尚未明确。本实验采用17-AAG联合应用奥沙利铂作用于结肠癌RKO细胞,观察PI3K/Akt、Erk通路及Bcl-2等凋亡相关蛋白变化,旨在观察奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡机制和探索潜在生物学靶点与信号通路,并为临床探索增强奥沙利铂药效提供实验基础。1材料和方法1.1实验分组和培养条件人结肠癌RKO细胞株购于中国科学院细胞生物学研究所(上海,中国),生长于含有10%灭活胎牛血清、100u/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱内培养,0.25%胰酶消化液消化传代,2～3天传代一次。所有实验均采用对数生长期细胞。本研究获得了医院道德伦理委员会的批准。1.2pi、rnase、甲基偶氮唑盐和mtt-pcr鼠抗人Erk和p-Erk、p-Akt和Akt、Hsp90、Caspase-3、Bcl-2、Bax和Actin单克隆抗体购于SantaCruz公司(SantaCruz,California,USA)。PI、RNase、甲基偶氮唑盐(Methylthiazolyltetrazolium,MTT)和17-AAG购于Sigma公司(StLouis,Missouri,USA)。奥沙利铂购买于恒瑞药业有限公司(Jiangsu,China)。将17-AAG用DMSO配成8μmol/L贮存液,-20℃冻存,实验时用培养液稀释成所需浓度,DMSO终浓度<0.01%,预实验表明,该浓度DMSO对细胞增殖无影响。1.3增殖抑制率测定取处于对数生长期的细胞,常规消化制成单细胞悬液,调整密度,接种于96孔培养板中,每孔180μl,对照组加入RPMI1640培养液,实验组分单药17-AAG、单药奥沙利铂、17-AAG与奥沙利铂联合组三组。17-AAG浓度分别为6.25、12.5、25、50、100、200nmol/L,奥沙利铂浓度分别为2.5、5、10、20、40、80μg/ml。加药后继续培养24、48、72h,终止培养前4h每孔加入MTT液20μl,到预定时间后加DMSO液200μl,振荡后用酶标仪于490nm波长条件下测定吸光度值。增殖抑制率(%)=1-(处理组平均A值-空白对照组平均A值)/(对照组平均A值-空白对照组平均A值)×100%。计算抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)。实验重复3次,取平均值,并绘制细胞增殖抑制曲线。1.4凋亡百分率测定分别收集对照组及处理组细胞1×106个,用体积分数70%的冷乙醇4℃固定24h,冷PBS洗2次,加入RNaseA(20μg/ml)37℃孵育30min后,加入终浓度为10g/L的PI,避光反应30min后进行流式细胞仪进行DNA含量检测,测定,判定凋亡百分率。FL2-A代表DNA含量,纵坐标代表细胞数,CELLQuest软件(BectonDickinson,SanJose,California,USA)进行细胞周期分析。1.5蛋白定量和转印分别收集对照组及处理组细胞1×107个,将对照组和处理组的细胞加RIPA裂解液(0.1%SDS,1%Triton-100,150mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA(PH8.0),10mmol/LTris-HCL(PH7.5))在冰上裂解30min,12000r/min离心30min,取上清液,采用Lowry法进行蛋白定量。与3×Buffer缓冲液混合后,煮沸5min。取50μg蛋白样品在15%的SDS-聚丙烯凝胶中电泳约3h,然后转印至硝酸纤维素膜上2h。用5%脱脂奶粉封闭1h,按预染Marker标记的分子量剪裁转印膜,分别加入Hsp90(1∶500)、p-Akt(1∶1000)、Akt(1∶1000)、p-Erk抗体(1∶1000)、Erk(1∶500)、Caspase-3(1∶250)、Bcl-2(1∶300)、Bax(1∶300)及β-actin(1∶1000),过夜。TBST洗4次后加入辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶800)室温作用30min,ECL法显色,GIS凝胶图像分析系统拍照并分析处理。1.6统计分析.所有数据均为3次独立实验结果,以(x¯±s)(x¯±s)表示,采用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析和t检验。P<0.05认为差异有统计学意义。2结果2.11-aag诱导的rko细胞凋亡6.25～200nmol/L17-AAG处理RKO细胞24、48、72h,MTT结果显示17-AAG抑制RKO细胞增殖,并呈时间-剂量依赖关系,见图1A。17-AAG作用细胞48、72h后,IC50分别为(199.87±6.24)nmol/L、(85.35±3.27)nmol/L(P<0.05)。25～200nmol/L17-AAG作用于RKO细胞24h,流式细胞术检测显示17-AAG可以诱导RKO细胞凋亡,随着浓度增加,凋亡率增加,最高至(9.0±2.3)%,见图1B。同时Westernblot检测显示在17-AAG诱导细胞凋亡过程中抑制Hsp90蛋白表达,随着浓度增加,Hsp90表达下降,见图1C。2.21奥沙利铂对17-aag的诱导表达作用2.5～80μg/ml奥沙利铂处理RKO细胞24h、48h和72h后,MTT结果显示奥沙利铂抑制RKO细胞增殖,并呈时间-剂量依赖关系,见图2。24h、48h、72h的抑制细胞增殖50%的药物浓度(IC50)分别为(50.89±4.58)μg/ml、(24.41±3.94)μg/ml、(12.87±2.06)μg/ml(P<0.05)。为了评价奥沙利铂与17-AAG之间的相互影响,2.5～80μg/ml奥沙利铂联合(6.25～200)nmol/L17-AGG作用RKO24～72h,与单药奥沙利铂或17-AAG比较,抑制细胞增殖明显增强,见图2。RKO细胞的CI值均小于1,说明在RKO细胞中17-AAG与奥沙利铂存在协同作用。2.31奥沙利铂对重组rko细胞凋亡的影响根据奥沙利铂48、72h的IC50值,选取10、20μg/ml奥沙利铂分别作用于RKO细胞24h,流式细胞术检测显示:10、20μg/ml奥沙利铂作用RKO细胞后出现Sub-G1峰,凋亡率分别为(8.7±1.5)%、(15.2±2.1)%(P<0.05),见图3。100nmol/L17-AAG联合不同浓度奥沙利铂作用于细胞24h后,RKO细胞凋亡率分别由(8.7±1.5)%、(15.2±2.1)%增至(15.3±1.2)%、(34.2±2.6)%(P<0.05)。以上结果提示17-AAG具有增强奥沙利铂诱导RKO细胞凋亡的能力。2.4奥沙利铂对rako细胞bax和bcl-2表达的影响20μg/ml奥沙利铂作用于RKO细胞1～24h后,Westernblot检测显示:存在p-Akt、p-Erk的短暂活化,其中p-Akt的表达自1h起开始上调,6h达高峰,24h下降明显,而总的Akt蛋白水平没有明显变化。而p-Erk的活化更为短暂,1h时短暂活化后即开始下降,总的Erk蛋白水平没有明显变化,见图4A。10μg/ml和20μg/ml奥沙利铂分别作用RKO细胞24h,Westernblot结果显示,Bcl-2蛋白表达分别下调至对照组的45%和37%,Bax蛋白表达分别上调至对照组的1.27和1.87倍,Bax/Bcl-2比值分别增加至对照组的2.82和5.05倍,同时使Caspase-3活化裂解,见图4B。进一步的检测中,Westernblot结果显示,100nmol/L17-AAG单独作用细胞24h后p-Akt、Akt、Bcl-2、Bax的表达水平均无明显变化,p-Erk活化明显受到抑制,见图4C,而联合20μg/ml奥沙利铂后与单药奥沙利铂相比,Bcl-2蛋白表达下调至奥沙利铂组的36%,Bax蛋白表达分别上调至奥沙利铂组的1.35倍,Bax/Bcl-2比值增加至奥沙利铂组的3.75倍,见图4C,提示17-AAG与奥沙利铂存在协同效应。在进一步的信号通路蛋白检测中发现,p-Erk下调更明显,而p-Akt无明显变化,提示17-AAG通过抑制Erk通路活化发挥与奥沙利铂的协同作用,见图4C。3-aag与奥沙利铂协同作用近年来,提高恶性肿瘤的疗效主要着眼点是促使肿瘤细胞凋亡。奥沙利铂属于第三代铂类抗癌药,有研究报告,奥沙利铂能够抑制结肠癌细胞Akt的磷酸化,我们的研究结果显示奥沙利铂诱导结肠癌RKO细胞凋亡的过程中抑制Akt磷酸化的同时也抑制了Erk的磷酸化,提示奥沙利铂诱导结肠癌细胞凋亡时可能存在多个作用靶点,结果也同时显示奥沙利铂可活化裂解Caspase-3,并上调Bax,下调Bcl-2的表达。Hsp90是细胞内最活跃的分子伴侣蛋白之一,与肿瘤的发生发展有着密切的关系。作为Hsp90的特异性抑制剂,肿瘤细胞来源的Hsp90对17-AAG具有高亲和力。临床前研究已经证实了17-AAG的抗肿瘤作用,本研究显示17-AAG亦能诱导结肠癌细胞凋亡,同时在17-AAG诱导细胞凋亡过程中抑制Hsp90蛋白表达,随着浓度增加,Hsp90表达下降。大量临床前研究显示,17-AAG增加肿瘤对化疗药物的敏感度。Rakitina等报道17-AAG增强奥沙利铂诱导结肠癌HCT116等细胞凋亡,并伴有G1/S期阻滞。我们采用100nmol/L17-AAG联合不同浓度奥沙利铂作用于RKO细胞后发现,细胞凋亡率增加,提示17-AAG增强奥沙利铂诱导RKO细胞凋亡,但未观察到明显的G1/S期阻滞。17-AAG联合奥沙利铂后与单药奥沙利铂相比,Bcl-2蛋白表达下调至奥沙利铂组的36%,Bax蛋白表达分别上调至奥沙利铂组的1.35倍,Bax/Bcl-2比值增加至奥沙利铂组的3.75倍,进一步提示提示17-AAG与奥沙利铂存在协同效应。细胞的存活主要取决于增殖和凋亡信号的平衡。PI3K/Akt和Erk信号转导通路是细胞内两条主要的促增殖和抗凋亡通路,在肿瘤细胞恶性增殖、血管新生和转移以及对放化疗的拮抗中起着重要作用。而HSP90可以通过维持Raf-1的活性而间接调控Raf-1/MEK/ERK通路,最终影响了细胞的增殖、分化、恶变以及细胞的存活。现在的研究表明,HSP90抑制剂并不仅仅单一的作用于Erk一个靶点,还包括cyclinE/CDK2、Akt、等信号蛋白。Rakitina等报道,17-AAG单独作用结肠癌HT29、SW480等细胞时抑制p-Akt,但对p-Erk影响较小,而在联合奥沙利铂诱导细胞凋亡过程中,同时抑制p-Akt、p-Erk表达。在我们的研究中,17-AAG单独作用