酶切体系的建立

酶切体系的建立酶切体系的建立一、 建立一个标准的酶切反应目前大多数研究者遵循一条规则，即 10个单位的内切酶可以切割 1μg不同来源和纯度的 DNA。通常，一个 50μl的反应体系中，1μl的酶在1XNEBuffer终浓度及相应温度条件下反应1小时即可降解1μg已纯化好的DNA。如果加入更多的酶，则可相应缩短反应时间；如果减少酶的用量，对许多酶来说，相应延长反应时间（不超过16小时）也可完全反应。二、 选择正确的酶不言而喻，选择的酶在底物DNA上必须至少有一个相应的识别位点。识别碱基数目少的酶比碱基数目多的酶更频繁地切割底物。假设一个GC含量50%的DNA链，一个识别 4个碱基的酶将平均在每 44（256）个碱基中切割一次；而一个识别6个碱基的酶将平均在每46（4096）碱基切割一次。内切酶的产物可以是粘端的（3＇＇或5＇＇突出端），也可以是平端的片段。粘端产物可以与相容的其它内切酶产物连接，而所有的平端产物都可以互相连接。相关信息参见目录的CompatibleCohesiveEndsAndRecleavableBluntEnds一文。三、 酶内切酶一旦拿出冰箱后应当立即置于冰上。 酶应当是最后一个被加入到反应体系中 （在加入酶之前所有的其它反应物都应当已经加好并已预混合）。酶的用量视在底物上的切割频率而定。例如，超螺旋和包埋法切割的 DNA通常需要超过1U/μg的酶才能被完全切割。参见目录第 244和264之"切割质粒DNA"和"包埋法切割 DNA"。四、DNA待切割的 DNA应当已去除酚、氯仿、乙醇、 EDTA、去污剂或过多盐离子的污染，以免干扰酶的活性。DNA的甲基化也应该是酶切要考虑到的因素。关于甲基化的内容，参见第252页至253页之甲基化相关内容。五、 缓冲液对于每一种酶 NEB都提供相应的最佳缓冲液， 可保证几乎100%的酶活性。使用时的缓冲液浓度应为 1X。有的酶要求100μg/ml的BSA以实现最佳活性。在这种情况下，我们也相应提供 100X的BSA（10mg/ml）。不需要 BSA的酶如果加了BSA也不会受太大影响。 关于缓冲液更详细的信息参见第页。六、 反应体积内切酶活力单位的定义是： 1小时内，50μl反应体积中，降解1μg的底物DNA所需的酶为一个活力单位。因此酶：DNA的反应比例可以由此确定。较小的反应体积更容易受到移液器误差的影响。为了将甘油的浓度控制在5%以下，要注意酶的体积不要超过总体积的10%（一般酶都贮存于50%的甘油中）。七、 混合这是非常重要然而常常被忽略的一步。想要反应完全，必须使反应液充分混合。我们推荐用枪反复吸取混合，或是用手指轻弹管壁混合，然后再快速离心一下即可。注意：不可振荡！八、 反应温度大部分酶的反应温度为 37°C；从嗜热菌中分离出来的内切酶则要求更高的温度。 一般为50-65°C不等。参看第244页Activityofthermophilesat37 °C。九、 反应时间1酶活单位的定义时间为 1小时。如果加入的酶较多，可以相应地缩短反应时间；反之，如果加入的酶量较少，也可以延长时间以使反应达到完全。参见第241页酶在反应中的存活时间。十、终止反应如果不进行下一步酶切反应，可用终止液来终止反应。在NEB我们使用如下反应终止液： 50%的甘油， 50mMEDTApH8.0），和0.05%溴酚蓝（10μl/50μl反应液）。如果要进行下一步酶切反应，可用热失活法终止反应（ 65°C或85°C，20分钟）。热失活并不能适用于所有的酶，详情参见第240页热失活表。此外，酚/氯仿抽提也可以用于终止反应。十一、贮存大部分酶应贮存于-20°C。少部分酶则须在-70°C长期保存。详情请参见相关酶的DATASHEET或目录相关部分。10XBUFFER和100XBSA于-20°C保存。BSA不能与NEBuffer混合后保存，否则将会出现 BSA沉淀。十二、稳定性每隔1-2个月都会对所有的酶有一个活性检测； 最近的一次检测结果将被贴在售出的每一管酶上。 通过三十多年来的经验，我们发现大部分酶在推荐的保存缓冲液里在 -20°C条件下十分稳定。高于 -20°C条件下稳定性将有所降低。十三、对照反应如果发现您的DNA底物不能被成功切开，可以进行对照实验以查明原因。具体方法如下：将不加内切酶的底物 DNA（待切底物）与加入了内切酶的对照DNA（有多个已知酶切位点）同时进行反应。若实验结果表明底物 DNA降解，则说明DNA在纯化过程中或反应液里引入了核酸酶污染；若实验结果发现底物 DNA保持完整，而对照DN