高密度固体发酵白酒糟的研究

高密度固体发酵白酒糟的研究

白酒灰是酒精生产的主要副产品。中国每年约有2000万吨新鲜白酒灰，相当于600万吨干酒灰。白酒糟水分大,酸度高,易腐烂变质,不易保管和运输,且其中含有50%左右难于消化的稻壳,直接饲喂效果欠佳。因此,目前绝大多数白酒糟都以低廉价格作为粗饲料,部分作为废弃物任意堆放,严重污染环境。我国是一个饲料蛋白资源严重短缺的大国,每年需从国外进口大量豆粕、鱼粉等以填补国内市场的不足。基于此,本研究以白酒糟为基质进行酵母细胞的高密度固体发酵,通过提高白酒糟中的酵母细胞数量,既可充分利用白酒糟,减少它对环境的污染,又可提高其营养价值,使之成为新型的蛋白饲料,创造出更大的经济价值,从而更好地满足养殖业和农牧业的需求,具有十分重要的现实意义。1材料和方法1.1实验材料1.1.1病毒酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae),华中农业大学农业微生物学国家重点实验室保藏。1.1.2复合酶制剂浓度固体发酵基础培养基:将白酒糟于60℃烘48h,过60目筛,向其中添加适量复合酶制剂。其中复合酶制剂由武汉新地生物技术发展有限公司提供,白酒糟由湖北十堰白泉酒业有限公司提供。酵母菌活化培养基:YPD液体培养基;酵母菌平板计数培养基:YPD固体培养基。1.2实验方法1.2.1母细胞激活法挑取酵母菌一环,接种于200ml的YPD液体培养基中28℃、200r/min摇瓶培养24h,得到活化好的酵母菌悬液备用。1.2.2计算螺母细胞的方法酵母菌生长曲线的测定:稀释涂平板计数法;酵母细胞总数的测定:显微镜血球计数板直接计数法。1.2.3固体发酵条件的优化1.2.3.酵母菌种发酵250ml三角瓶中分别装入干酒糟5、10、15、20g,加入干糟质量4%的复合酶制剂,接种活化后的酵母菌液,接种量为1亿/g干酒糟,控制料水比为1:1,摇匀,封口膜封口后于30℃恒温箱中培养,培养周期为72h,自然pH值。自发酵起始每隔12h翻料一次至发酵结束。每组设3个平行,以发酵结束后血球计数法所得酵母总数为指标确定装料量。1.2.3.复合酶制剂添加量的确定选取装料量10g,按干糟质量的1%、2%、3%、4%、5%添加复合酶制剂,并设不加复合酶制剂的对照,其余条件不变。每组设3个平行,以发酵结束后血球计数法所得酵母总数为指标确定复合酶制剂添加量。1.2.3.调整培养基初始含水量选取装料量10g,加入干酒糟质量4%的复合酶制剂,调整培养基初始含水量分别为40%、45%、50%、55%、60%,其余条件不变。每组设3个平行,以发酵结束后血球计数法所得酵母总数为指标确定初始水分。1.2.3.固体基质接种量选取装料量10g,加入干糟质量4%的复合酶制剂,按0.1、0.3、0.5、0.7、1、2亿/g固体基质接种量接入活化后的酵母悬液,调整培养基初始含水量为45%,其余条件不变。每组设3个平行,以发酵结束后血球计数法所得酵母总数为指标确定接种量。1.2.3.初始ph值对养基回收率的影响选取装料量10g,加入干糟质量4%的复合酶制剂,以稀硫酸和CaO调整培养基的初始pH值分别为4.0、5.0、6.0、7.0,对照组为自然pH值组(CK),接种量0.7亿/g干酒糟,调整培养基初始含水量为45%,其余条件不变。每组设3个平行,以发酵结束后血球计数法所得酵母总数为指标确定初始pH值。1.2.3.发酵温度对酵母总菌数的影响选取装料量10g,加入干糟质量4%的复合酶制剂,自然pH值,接种量0.7亿/g干酒糟,调整培养基初始含水量为45%,分别在25、28、30、37℃的发酵温度下,发酵84h,每隔12h测定酵母总菌数,其余条件不变。每组设3个平行,以血球计数法所得酵母总数为指标确定最适培养温度和培养时间。1.2.4固液体发酵技术的优化1.2.4.无机氮源添加量本实验选用淀粉和糖蜜作为碳源,设定碳源添加量为8%(w/w);选用NH4Cl、NaNO3、NH4NO3、(NH4)2SO4、尿素作为无机氮源,胰蛋白胨作为有机氮源,设定氮源添加量为0.5gN/kg干糟。外加碳、氮源均配置成一定浓度的混合营养液,向基础培养基中等体积补加进去,摇匀分散,按照优化后的固体发酵条件培养至72h。每组设3个平行,以发酵结束后酵母总数为指标确定所添加碳、氮源的种类。1.2.4.糖蜜、尿素的添加量对高密度发酵的影响向基础培养基中添加相同体积(设定为2ml)不同浓度的糖蜜和尿素混合液(见表1),按照优化后的固体发酵条件培养至72h,研究不同的糖蜜、尿素添加量对酵母高密度发酵的影响,设计两因素四水平的正交实验表,以酵母总数为指标进行正交实验。2结果与分析2.1优化固发条件2.1.1装料量对酵母生长的影响装料量可在一定程度上影响酵母的生长。装料量少,水分蒸发快,不利于酵母微环境稳定,而且设备利用率较低;装料量多,透气性差,不利于氧气等营养物质的传输,而且会出现酒糟中心温度过高的现象。试验结果见图1。从图1中可以看出,装料量过低或过高都对酵母生长不利,当装料量为10g时,酵母生长较好。因此选择最适装料量为250ml三角瓶装10g。2.1.2酵母质降解实验复合酶制剂中含有β-葡聚糖酶、果胶酶、纤维素酶、淀粉酶等,可以将酒糟中的纤维素、淀粉类物质降解,有利于酵母对酒糟中难以自行利用的营养物质的吸收利用,有利于酵母的快速生长繁殖。实验结果见图2。从图2中可以看出,在酒糟中添加复合酶制剂的效果非常明显,添加复合酶制剂与不添加的对照组差异很大,但当添加量为4%~5%时,变化不大。为节约成本,选用最适添加量4%。2.1.3酒糟含水量对酵母菌生长的影响培养基含水量是影响固态发酵结果的主要因素之一。基质水分含量过低,会减缓和妨碍菌体生长繁殖;基质水分含量过高,会造成供氧不足,同样影响菌体生长,只有基质含水量适中时,酵母生长才比较旺盛。实验结果见图3。从图3中可以看出,当酒糟含水量从40%~60%变化时,酵母数量先增加后减少,当含水量在45%~50%时,酵母菌数约为17亿/g干糟。因此选择最适含水量45%~50%。2.1.4接种量对酵母菌多样性的影响接种量与培养基的利用率直接相关,接种量大会加速营养物质的利用,缩短生长周期;接种量太少,不能充分利用营养物质,而且会导致发酵周期延长,从而提高染菌的概率。实验结果如图4所示,当接种量为0.7亿/g干酒糟时,酵母总数约18.9亿/g干糟。因此选择最适接种量为0.7亿/g干酒糟。2.1.5初始ph值对酵母菌生长的影响pH值是决定微生物生长状况的重要因素之一。酵母菌能在pH值为3~8.5的范围内生长,最适pH值为4.5~5.0。pH值可影响酵母细胞膜通透性、细胞内酶活、营养物质的存在状态以及酵母对其吸收等,对酵母生长的影响较大。适宜的酸碱度有利于酵母生长,酵母的代谢活动也会影响环境pH值。实验结果见图5。从图5中看出,自然pH值下酵母总数为19.1亿/g干糟,经测定,该酒糟自然pH值为3.6。随着pH值的增高,酵母数量在减少。酵母之所以会在初始pH值低于4.5的培养基中生长良好,是因为在发酵过程中,培养基的pH值会增高(经测定发酵终点的pH值为6.5左右),所以初始pH值适当低一些有利于酵母的高密度发酵培养。因市场上大部分酒糟初始pH值均偏酸,选择自然pH值,也有利于实际生产应用。2.1.6发酵温度和发酵周期温度的高低直接影响酵母的生长。温度过低,酵母只在基质中下层生长,温度过高只在基质表面生长且会杀死菌种,同时,培养温度和时间具有相关性。实验结果见图6,从图6中可以看出,在温度为30℃时,酵母在各个时间段的生长都最好,据此酵母培养温度选用30℃。同时可以看出,在48h之前酵母增加比较快,48h之后虽然也在增加,但是趋势变缓,72h达到最高峰,此后酵母数量开始下降。因此初步确定发酵温度30℃,发酵周期为72h。从以上实验得到酿酒酵母高密度发酵白酒糟的最适发酵条件为:250ml三角瓶装入干白酒糟10g,加入干糟质量4%的复合酶制剂,按0.7亿/g干糟的量接入活化后的酵母,调整酒糟的含水量为45%~50%,自然pH值,封口膜封口后于30℃恒温箱中发酵培养至72h结束。此时酵母数量可达到19.8亿/g干糟。2.2固液体发酵技术的优化在菌体生长中后期由于营养不足、碳氮源不平衡、微量元素缺乏,菌体会过早衰老。因此有必要向基础培养基中补入一定的营养物质。2.2.1添加糖蜜、氮源、尿素对酵母菌生长的影响碳源是氮源微生物生长菌体时需要量最大的物质,在发酵前期消耗很快,到了中后期,菌体要维持活性必须外加一定量的碳氮源,以延缓菌体衰老。实验结果如图7、图8所示。从图7中可以看出,在外加碳源中,添加糖蜜的实验组生长较好,分析原因可能是因为糖蜜作为制糖的主要副产物,总糖分为50%左右,它不仅含有酵母生长可直接利用的碳源,还含有微量元素及维生素等多种成分,可促进酵母生长;在外加氮源中,添加尿素的实验组生长较好,它的主要作用是调节pH值和补充酵母菌生长所需氮源,从而控制代谢活动。这和姚晓红等的研究结果一致。据此确定最适碳、氮源分别为糖蜜和尿素。2.2.2最优发酵条件及工艺以补料种类中糖蜜和尿素添加量为基础,设计了2因素4水平的正交实验。通过正交实验L16(4)2找到糖蜜和尿素的最适添加量。正交实验结果如表2所示。从表2看出糖蜜的补料量是对酵母高密度发酵影响较大的因素,其次为尿素添加量。理论上最佳添加量为A3B3,即糖蜜添加量8%(w/w干糟),尿素添加量0.5gN/kg干糟。按照优化后的发酵条件进行固态发酵,酵母总数达到30.3亿/g干糟。这比只采用最佳发酵条件而未中间补料的工艺,酵母数量提高了53%左右。按最优发酵条件及工艺进行平行实验,所测得酵母总数分别为29.5、30.4、29.9亿/g干糟,平均值为30亿/g干糟,说明该优化条件具有良好的重现性和可靠性。酿酒酵母高密度固态发酵白酒糟实验室最佳发酵条件及工艺为:250ml三角瓶装入干白酒糟10g,并补加混合营养液2ml(以干糟质量的8%添加糖蜜,以0.5gN/kg干糟的量添加尿素),摇匀分散,加入干糟质量4%的复合酶制剂,按0.7亿/g干糟的量接入活化后的酵母,调整酒糟的含水量为45%~50%,封口膜封口后于30℃恒温箱中发酵培养,自发酵起始每隔12h翻料一次至72h固体发酵结束。最终酵母总数可达30亿/g干糟。3复合酶制剂发酵及活性物质含量白酒用高粱、玉米、小麦、稻谷、大麦等纯粮单一原料或者混合原料发酵而成。白酒发酵主要是对原料中的淀粉转化,对原料中的蛋白质成分转化利用较少,它们基本保存在酒糟中。根据有关文献的分析测定,由于发酵的浓缩作用(原料淀粉被利用),酒糟的蛋白质含量(干基)与原料相比,可以提高一倍以上,达到15%以上,除蛋白质含量较高外,酒糟蛋白质的氨基酸组成比较平衡,基本上是全价的;酒糟中矿物质含量也很丰富,其中钙、铁等主要微量元素含量比较高;此外,还含有多种维生素,以及菌体自溶产生的各种生物活性物质(如嘌呤、嘧啶、类脂化合物、酶类),具有生物转化为高质量饲料的潜质,这也是本实验中酵母得以快速生长繁殖的基础。本研究仅在发酵初始阶段