耶尔森氏菌及检验

耶尔森氏菌及检验耶尔森氏菌属包括11个种，其中对人有致病性的有三种：小肠结肠炎耶尔森氏菌、假结核菌和鼠疫菌。只有小肠结肠炎耶尔森氏菌和假结核菌已确定是食源性病原体。鼠疫耶尔森氏菌引起黑疽病，不通过食品传染。1981年根据DNA以及生化和形态特征的相关资料，与小肠结肠炎耶尔森氏菌极为密切3个同源群被作为耶尔森氏菌的新种命名，它们是弗氏耶尔森氏菌、中间型耶尔森氏菌和克氏耶尔森氏菌。一、生物学特性1、 形态特性本菌为革兰氏阴性杆菌或球杆菌，大小为x〃m多单个散在，有时排列成短链或成堆。本菌不形成芽胞，无荚膜，有周鞭毛；但其鞭毛在30r以下培养条件形成，温度较高时即丧失，因此表现为30r以下有动力，而35r以上则无动力。2、 培养特性本菌生长温度为30-37r，但在22-29r才能使本菌的某些特性出现。4r时能保存和繁殖。本菌世代时间长，最短亦需40分钟左右。在SS或麦康凯琼脂上于25r经24小时培养，菌落细小，至48小时直径才增大成。菌落圆整、光滑、湿润、扁平或稍隆起，透明或半透明；在麦康凯琼脂上菌落淡黄色，如若微带红色，则菌落中心的红色常稍深。本菌在肉汤中生长呈均匀混浊，一般不形成菌膜。3、生化特性表一：本菌的生化特性及其与近缘菌的鉴别反应鼠疫耶氏菌假结核耶氏菌小肠结肠炎耶氏菌中间型耶氏菌费氏耶氏菌克氏耶氏菌赖氨酸精氨酸鸟氨酸动力(22-26°C)动力(35-37C)尿素+++++苯丙氨酸脱氨基酶+山梨醇+/-++++纤维二糖核糖醇肌醇+/+/+/+/-蔗糖鼠李糖棉子糖+/-蜜二糖+/-枸橼酸盐+/-+/-V-P+/-吲哚+/-+/-水杨忒+/-+/-+/-++-/+七叶忒+/++-脂酶--+/+/-+/-+/-吡嗪酰胺酶+/+++4、生物型小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型分类方法有几种，目前FDA细菌分析手册第八版中采用的是Wanters1981的分型方法。表二：小肠结肠炎耶尔森氏菌的生物型生化测试生物型反应1A1B23456脂酶七叶甙/水杨甙(24h)+/-吲哚++(+)木糖海藻糖++++++阳葡糖甙酶+V-P++++/-c+(+)注：（）表示迟缓反应V表示可变反应C在日本发现血清型为0:3的生物型5、血清型小肠结肠炎耶尔森氏菌菌株根据其耐热性和耐受高压灭菌的菌体抗原能被血清学分型。Wanters将小肠结肠炎耶尔森氏菌和相关菌归纳为54个血清群，Aleksii和Bockemuh等人提议将小肠耶氏菌的血清群简化为18个群。目前下列血清群的致病菌株已通过鉴定，它们是0:1,2a,3；0:2a,3；0:3；0:8；0:9；0:4,32；0:5,27；0:12,25；0:13a,13b;0:19；0:20；0:21。引起人类疾病的主要血清群是0:3,0:8,0:9和0:5,27。二、流行病学1、 细菌分布小肠结肠炎耶尔森氏菌分布很广，可存在于生的蔬菜、乳和乳制品、肉类、豆制品、沙拉、牡蛎、哈和虾。也存在于环境中，如湖泊、河流、土壤和植被。已从家畜、狗、猫、山羊、灰鼠、水貂和灵长类动物的粪便中分离出该菌。在港湾周围，许多鸟类包括水禽和海鸥可能是带菌者。猪的带菌率较高，日本报告检出率为4%，加拿大为％，丹麦为10-17%。在猪中，该菌最易在扁桃腺中发现。2、 流行情况确定耶尔森氏菌作为一种食源性疾病的有关特性了解较多，其在世界范围内已爆发多起，食品和饮水受到污染，往往是爆发胃肠炎的重要原因。七十年代在加拿大魁北克地区暴发过两起，有138名儿童感染，源于摄入生牛奶。1976年在美国纽约爆发过一起，有217名学生感染，在这起发病过程中涉及的是巴氏消毒巧克力奶。1980年发生于华盛顿的一起有87人感染，污染源是用未经氯处理的泉水做的豆腐。由本菌引起的胃肠炎或中毒爆发，在欧洲以冬春季节较多，夏季较少，而日本则以夏季发病率较高。在我国福建省南部地区，该菌是冬春季腹泻的重要病原菌，根据陈元川案于不同季节对猪带菌动态的调查，发现两个养猪场仅在冬春两季有该菌检出，检出的菌株均为O3血清型。3、临床症状小肠结肠炎耶尔森氏菌是30年代引起注意的急性胃肠炎型食物中毒的病原菌，为人畜共患病。潜伏期约摄食后3-7天，也有报导11天才发病。病程一般为1-3天，但有些病例持续5-14天或更长。主要症状表现为发热、腹痛、腹泻、呕吐、关节炎、败血症等。耶尔森氏菌病典型症状常为胃肠炎症状、发热、亦可引起阑尾炎。有的引起反应性关节炎，另一个并发症是败血症，即血液系统感染，尽管较少见，但死亡率较高。本菌对易染人群为婴幼儿，常引起发热、腹痛和带血的腹泻。三、致病性1、肠毒素该菌能产生耐热性肠毒素，，能耐热121°C30分钟，能在4°C保存7个月，pH1-11中稳定。但肠毒素的产生仅限于22-25Co血清型03、08和09几乎经常产生肠毒素，在其他血清型中也有产生肠毒素的菌株。该肠毒素被摄入即可引起发病。2、 侵袭性Hela细胞感染，血清型O1、03、04、O5B、08、09、015、018、020、021和022都能侵入Hela细胞，鉴于Hela细胞感染阳性株多是人类致病的常见血清型，以及从人和动物死亡所见肠类的侵入模型，表明Hela细胞侵入性在小肠结肠炎耶尔森氏菌腹泻的发病机理上是重要的。Sereny试验，有人将11株小肠结肠炎耶尔森氏菌的菌悬液接种于豚鼠眼结膜，有6株引起严重的角膜结膜炎，即Sereny试验阳性。这6株均为08血清型。3、 自凝性。1980年Laird等人提出了一种测定本菌毒力的简易方法，即将试验菌接种于二管含10%小牛血清的组织培养液内，分别置22°C和36+1^培养，若22°C培养，菌液混浊，而37C培养，细菌凝结，上层液体透明，即为有毒力的菌株，称为自凝阳性。在检查的180株菌中有25株阳性，这些阳性菌株均能引起腹泻。4、 VW抗原已知该菌的某些菌株具有与鼠疫耶尔森氏菌和假结核耶尔森氏菌在免疫学上相同的VW抗原。其在37C生长时需要钙而在25C生长时不需要钙的菌株即含VW抗原。Karmali等人将从病人粪便检出的021血清型自凝阳性的菌株，在草酸镁琼脂上于35°C培养不生长，用于口服小鼠则产生腹泻。可见自凝阳性与缺钙培养基上35C无生长能力是一致的，能使小鼠发生腹泻。5、毒性质粒。耶氏菌病和小肠结肠炎耶尔森氏菌带有41-48Mdal的质粒有关。这被认为是毒性质粒，即与毒力有关的质粒。有人将失去毒性质粒的08、03和09型菌株用小鼠作喂饲试验，均不发病，但用带毒性质粒的08和03型菌株试验时，小鼠则均发生腹泻或死亡。且菌株自凝试验的结果与毒性质粒的存在与否相一致。四、检验与控制A、增菌1、 无菌称取样品于225mL，蛋白胨山梨醇胆汁肉汤中，均质30秒，置10C培养10天。2、 如果怀疑产品为高含量耶氏菌，在肉汤培养前各取划线于麦康凯琼脂和cefsulodin�irgasan�新生霉素(CIN)琼脂。然后取1mL均质液至9mL%盐水(含%KOH)中，混合数秒钟，各取划线麦康凯和CIN琼脂平板。将平板置30C培养1天，把平板上生长的菌落转移到Whatmam541滤纸上，用于DNA克隆杂交技术直接检测耶氏菌的致病基因。如果耶氏菌含量较低，省去这一步。3、将经10天培养的增菌肉汤充分混合，转移至1mL%盐水中，混合5-10秒。连续划线于麦康凯平板和CIN平板。另取增菌液至1mL%盐水中，如上在划线前混合5-10秒。置平板于30r培养1天。B、 细菌分离。检查经1天培养的麦康凯平板，排除红色或粘液状菌落，挑取小的，偏平，无色的或淡粉红色菌落。同时检查CIN平板，挑取具有紧红色中心整个边缘明显无色的小菌落。用接种针将所选菌落穿刺接种于赖氨酸精氨酸铁琼脂斜面。Christensen�s尿素琼脂平板或斜面。胆汁七叶甙琼脂平板或斜面。室温培养48小时。在LAIA中的培养物会产生硷性斜面，酸性底层，不产生气体和H2S的反应，被认为是尿素酶阳性的可疑耶氏菌。去除在LAIA中产H2S或产气或尿素酶阴性的培养物。C、 鉴定将LAIA斜面上的培养物划线接种于厌氧卵黄琼脂，置室温培养。使用AEY上的生长物进行纯度检查、脂肪酶反应氧化酶试验、革兰氏染色、和生化试验的接种。将AEY上的菌落接种于生化试验培养基，置室温培养3天。D、 解释耶尔森氏菌为氧化酶阴性、革兰氏阴性的杆菌，表1和表2可用于鉴定耶氏菌的菌株和生物型。目前已知小肠结肠炎耶尔森氏菌生物型为1B、2、3、4、5具有致病性，这些生物型和第6生物型以及克氏耶氏菌不能快速水介七叶甙和发酵水杨甙。生物型6和克氏耶氏菌相当少，可以通过微弱发酵蔗糖加以区别，并且吡嗪酰胺酶均为阳性反应。对于生物型1B、2、3、4、5的小肠结肠炎耶氏菌可进一步