萤火虫荧光素酶报告基因的检测

萤火虫荧光素酶报告基因的检测转载请注明来自丁香园发布日期：2010-04-0810:24文章来源：北京原平皓生物技术有限公司关键词：荧光素酶事报告基因的化学发光检测&荧光检测的光吸收检测&点击次数：皮圜6801.应用说明荧光素酶(Luciferase)是自然界中能够产生生物荧光的酶的统称，其中最有代表性的是来自北美萤火虫(Photinuspyralis)体内的荧光素酶。萤火虫荧光素酶属于加氧酶(oxygenase)，其发光反应需要O2和Mg2+参与；有辅酶A(CoA)存在时能提高反应效率，增加发光时间。萤火虫荧光素酶无需翻译后修饰，即可表现出荧光素酶活性。因此可将萤火虫荧光素酶的基因插入不同载体，作为报告基因，在细胞中表达。RemmlilnantFirefly/OOH L皿畋_J .-N +A*1P+PP+CQ2+LigritTurnerBioSystems的ModulusTM单管型多功能检测仪与Promega'sSteady-Glo®的检测试剂盒连用为荧光素酶报告基因系统中的基因表达定量提供了一种非常简便的方法。同时荧光素酶报告基因系统中的转录调控也常常被用于研究细胞的整个培养过程中的生理情况。Steady-Glo试剂的发光半衰期大约为5小时，光信号能在加入试剂后5min到数小时之间都能检测到。同时Steady-Glo试剂应该与哺乳动物细胞培养基(RPMI1640,MEMa,DMEMandHam'sF12)相匹配，并且不会受到酚红和有机溶剂的影响。用具发光检测功能的ModulusTM单管型多功能检测仪检测时，荧光素酶的检测线性范围为1X10-18-1X10-11mol或几个数量级(图1)。实验由Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒(E2520)来完成，重组的萤火虫荧光素酶纯化，也用Promega产品(E1701)。

Steady-GioLuciferaseAssayLuciferase(moles)图1用Modulus单管型多功能检测仪与Promega的Steady-Glo试剂盒和重组荧光素酶检测所得结果。所需器材•具有发光检测模块的ModulusTM单管型多功能检测仪（http://www.yph-bio.com/equip/modulus/modulus.asp）（货号9200-001或9200-002）•1.5ml微型离心管•Steady-Glo荧光素酶检测试剂盒（E2520）•p200移液器和匹配枪头实验方案3.1试剂制备Steady-Glo底物：使用所提供的底物，-20°C下可稳定储存6个月；4°C下可储存1个月。Steady-Glo缓冲液：使用所提供的缓冲液，储存在25°C以下的环境条件下。Steady-Glo试剂：将整瓶Steady-Glo缓冲液加入Steady-Glo底物瓶中，颠倒混匀使底物彻底溶解，使用试验当天配制的试剂，或者将配好试剂储存在-20°C冰箱中，可储存2周。注：在检测时，Steady-Glo试剂应当维持在室温，因为荧光素酶的活性对温度比较敏感，配制后冻存的试剂应当在低于25°C条件下溶解，以确保试剂的性能，并且融化后还应充分混匀。一种最简单的方法就是将试剂在室温水浴下溶解。3.2仪器安装3.2.1关闭ModulusTM单管型多功能检测仪电源，根据操作手册安装发光检测模块。

3.2.1打开ModulusTM单管型多功能检测仪电源，打开后立即倒计时1min,让ModulusTM单管型多功能检测仪预热。3.2.2预热后，进行样品检测，仪器默认的方案是1s的检测时间。3.3样品分析3.3.1从培养箱或其他培养仪器中取出培养的细胞。注：为了获得最大的实验数据，加入试剂前应将培养细胞平衡至室温3.3.2向细胞培养液中加入等体积的Steady-Glo试剂。3.3.3静止5min使细胞充分裂解，然后将样品转移到1.5ml离心管中。3.3.4将1.5ml离心管插入模块中，点击"MeasureLuminescence"菜单开始检测。3.3.5记录下相对光强度检测结果，并且仪器能在显示屏上最多可显示出最近20个检测结果。4.关于ModulusTM单管型多功能检测仪ModulusTM单管型多功能检测仪(/equip/modulus/modulus.asp)是TurnerBiosystems公司生产的一款单管型多功能检测仪