基础生物工程大实验(第一部分1)

基础生物工程大实验阎欲晓粟桂娇广西大学生命科学与技术学院

2011.01

第一部分：酒精发酵大实验实验一双酶法制备淀粉水解糖实验二淀粉水解糖含量定量分析实验三酵母活化和游离酵母细胞发酵生产酒精实验四固定化酵母细胞发酵生产酒精实验五酒精蒸馏与酒精发酵液产物分析

第二部分：生物工程基本设备

实验六小型发酵罐的结构与使用

组织安排1、每2～3人为一组（每班最多安排12组），自由组合，把组员姓名写在实验数据表上，讲课完后统一交给指导老师。每次实验结束前，向指导老师领取实验数据单，将实验数据填写上去，指导老师签名后才能结束实验。2、课前请做好预习，实验过程中要勤于思考，老师在指导实验过程中会随时提问；上课要准时，不迟到早退；未经指导老师批准擅自离开实验室，以旷课计；遵守实验室规章制度，每次做完实验要把本组台面收拾干净，用过的实验器皿清洗干净放好，养成良好的实验习惯。每次实验安排的值日生要认真做好实验场所的卫生工作，完成值日工作后报告老师，经同意方可离开。以上表现记入平时成绩，占40%；操作规范和熟练程度、实验报告成绩占60%。

组织安排（生技081）指导老师：粟桂娇；阎欲晓助教：李才

生物工程实验室老师：李小梅、莫祺红、黄熙时间（18周）内容（1月4日）星期二：上午7:50起上课（全班）；糖化醪液的制备；酵母的活化、固定化（助教提前准备2%氯化钙溶液和无菌水）；葡萄糖标准曲线的制作；糖化醪液总糖和还原糖的测定；酵母的活化、游离酵母细胞接种和发酵；固定化酵母细胞清洗、接种（下午）（1月5日）星期三：上午7:50起上课（全班）；小型发酵罐的结构与使用（分4批，每批8-9人）安排4批（1月6日）星期三：下午14:40起上课（全班）；酒精蒸馏及酒精发酵液产物分析（固定化细胞和游离细胞发酵）

口试考核

组织安排（生技082）指导老师：粟桂娇；阎欲晓助教：丁猛生物工程实验室老师：李小梅、莫祺红、黄熙时间（19周）内容（1月10日）星期一：上午7:50起上课（全班）；糖化醪液的制备；酵母的活化、固定化（助教提前准备2%氯化钙溶液和无菌水）；葡萄糖标准曲线的制作；糖化醪液总糖和还原糖的测定；酵母的活化、游离酵母细胞接种和发酵；固定化酵母细胞清洗、接种（下午）（1月11日）星期二：上午7:50起上课（全班）；小型发酵罐的结构与使用（分4批，每批8-9人）安排4批（1月12日）星期三：下午14:40起上课（全班）；酒精蒸馏及酒精发酵液产物分析（固定化细胞和游离细胞发酵）

口试考核

每组织基本实验耗材

1瓶/组试剂有：0.1mol/LHCl；6mol/LHCl；6mol/LNaOH；DNS试剂；葡萄糖标准溶液(2.0mg/mL)；碘－碘化钾溶液；0.1%酚酞指示剂；2%CaCl2溶液；

500mL烧杯1个/组；洗瓶1个/组；6孔白瓷板1块/组；10mL移液管1支/组；10mL碱式滴定管；150mL三角瓶（活化酵母用）1个/组；150mL烧杯1个/组；6cm或9cm漏斗1个/组；滴定管架1台/组；100mL量筒1个/组；500mL三角瓶（配无菌水)1个/组；50mL三角瓶1个/组；精密pH试纸(pH2.7～4.7)(pH3.8～5.4)(pH0.5～5.0)(pH5.4～7.0)各1本/组；小试管筐1个/2组玻璃棒2根/组；250mL容量瓶2个/组；250mL烧杯2个/组；塑料滴管2支/组；铁架台（带铁圈、铁夹）2台/组；250mL三角瓶3个/组（其中1个用来配2%CaCl2溶液）；试管1.8×18cm20支/组

0～100℃红水温度计1支/组；可调电炉1台/组；石棉网1张/组

实验安全事项

灭菌锅、电炉、烘箱、水浴等高温避免烫伤浓硫酸、浓盐酸腐蚀性强避免烧伤玻璃器皿避免割伤重视！

酒精发酵大实验产品：酒精（乙醇）用途生产工艺化学合成法发酵法英文名称：ethylalcohol;ethanol分子式：C2H5OH相对分子量：46.07

本实验主要以木薯淀粉为原料，采用游离酵母细胞和固定化酵母细胞发酵生产酒精。

木薯淀粉为原料工艺流程如下：

酿酒活性干酵母→活化木薯淀粉→加水拌料→双酶法水解制糖→发酵→蒸馏→酒精

酿酒活性干酵母→

活化→固定化细胞1.学习并掌握淀粉双酶水解法制糖的原理及其操作工艺过程。2.掌握手持式折光仪测定糖含量的方法。

1双酶法制备淀粉水解糖

1.1实验目的淀粉双酶水解法制糖的原理。手持式折光仪测定糖含量的原理。

1.2实验原理

目前，发酵工业所用的原料多以淀粉或糖质为主，而许多微生物并不能直接利用淀粉。淀粉必须经过水解制成淀粉糖以后才能被酵母菌等微生物所利用。

工业生产上将淀粉水解为葡萄糖的过程称为淀粉的“糖化”，所制得的糖液称为淀粉水解糖或糖化醪液。本实验采用双酶法糖化制备糖化醪液，是以专一性很强的淀粉酶和糖化酶为催化剂，将淀粉水解为葡萄糖的方法。糖化醪液中主要的糖类是葡萄糖。淀粉双酶水解法制糖的原理（C6H10O5)n+nH2OnC6H12O6酸或酶淀粉的结构支链淀粉淀粉是由许多葡萄糖基团通过α-1,4-葡萄糖苷键聚合而成或通过α-1,6-糖苷键连接而成。直链淀粉还原末端非还原末端α-1,4糖苷键α-1,6糖苷键

液化：

α-淀粉酶（工业上称为液化酶）作用于淀粉时，可以从分子内部切开α-1,4-糖苷键，产生糊精、低聚糖和少量还原糖。淀粉双酶水解过程包括液化和糖化两个步骤。

糖化：

利用糖化酶将糊精及低聚糖水解为葡萄糖的过程。

淀粉水解速度主要与酶的用量、温度和pH值有关。酶催化反应对适合的温度和pH值要求很高。

手持式折光仪测定糖含量的原理

通过手持式糖度计测含糖量，可快速了解淀粉水解制糖的进程。

手持式折光仪，也称糖镜、手持式糖度计。

木薯淀粉，耐高温α-淀粉酶（酶活2000U/g），糖化酶（10万U/g），1mol/LHCl，1mol/LNaOH等

可调电炉，0～100℃红水温度计，0～32％手持式折光仪或0～80％手持式折光仪，恒温水浴锅等

500mL烧杯，玻璃搅拌棒，精密pH试纸，镜头纸，洗瓶,100mL量筒等1.3实验材料与设备1.4实验步骤100g木薯淀粉加水拌料(料：水=1：3）加入α-淀粉酶、CaCl2

调pH

？液化（温度？）沸水浴蒸煮冷却（温度？）调pH

？加入糖化酶糖化降温，调pH

糖化液量筒测量糖化液总体积V糖总（mL）

酒精发酵培养基（2瓶，120mL/瓶）手持糖量计测糖化液的含糖量；DNS法测定还原糖和总糖浓度1、记录手持式折光仪测得的糖含量，参照说明书进行温度校正。2、双酶水解制糖工艺中所选择的温度和pH的依据是什么？加入CaCl2有什么作用？3、目前常用的淀粉水解制糖的方法有哪几种？双酶法制糖的优缺点是什么？4、手持式折光仪测定糖含量的原理是什么？使用时有哪些注意事项？1.5实验结果与讨论讨论：淀粉水解糖中，主要成分是什么，另外还有哪些杂质？这些杂质中，哪些微生物能直接利用，哪些不能？

在淀粉水解糖液中，主要糖分是葡萄糖，另外，根据水解条件的不同，尚有数量不等的少量麦芽糖及其他一些二糖、低聚糖等复合糖类。除此以外，原料带来的杂质（如蛋白质、脂肪等）以及其分解产物也混入糖液中。葡萄糖、麦芽糖和蛋白质、脂肪分解产物（氨基酸、脂肪酸等）等是生产菌生长的营养物在发酵中易被各种菌利用；而一些低聚糖类、复合糖等杂质则不能被利用，它们的存在，不但降低淀粉的利用率．增加粮食消耗，而且常影响到糖液的质量，降低糖液中可发酵成分。1.5实验结果与讨论讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较1.5实验结果与讨论

用于制备淀粉的原料主要有薯类、玉米、小麦、大米等富含淀粉的农产品。根据原料淀粉的性质及采用的催化剂不同，淀粉水解为葡萄糖的方法有酸解法、酶解法以及酸酶结合法等三种。

1、酸解法

又称酸糖化法，它是以酸为催化剂在高温下将淀粉水解转化为葡萄糖的方法。1.5实验结果与讨论2、酶解法

酶解法是在酶的作用下进行的，反应条件较温和，不需要耐高温高压或耐酸腐蚀的设备；酶作为催化剂的特点是专一性强，副反应少，故水解糖液纯度高，淀粉转化率高；可在较高的淀粉乳浓度下水解。如酸解法一般使用10-12Bx（含18%--20%淀粉）的淀粉乳，而酶解法可用20—23Bx（含34%--40%淀粉）的淀粉乳，并且可以采用粗原料。用酶解法制得的糖液较纯净、颜色浅、无苦味、质量高，有利于糖液的充分利用。

优点讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较1.5实验结果与讨论2、酶解法

缺点

酶解法反应时间较长，设备要求较多，且酶是蛋白质，易引起糖液过滤困难。当然，随着酶制剂生产及应用技术的提高，酶解法制糖将逐渐取代酸解法制糖。

3、酸酶结合法

酸酶结合法是集中了酸解法和酶解法制糖的优点而采用的生产方法，它又可分为：

酸酶法酶酸法讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较1.5实验结果与讨论4、淀粉水解糖制备方法比较

问题说说酸水解法、酸酶法和酶水解法三种不同水解工艺的优劣？050温度（ºC）粘度(pas)不同水解工艺与糖化液的粘度的关系全酶酸酶酸

从制得的水解糖液的粘度来看，以酶解法为最低，酸解法最高，如图所示。讨论：淀粉水解糖的制备方法及比较从水解糖液的质量、原料利用率、糖收得率、耗能及对粗淀粉原料的适应情况来看，以酶解法最好，其次是酸酶法，酸法最差。从淀粉水解的整个过程所需的时间来看，酸法最短，酶法最长。

掌握还原糖和总糖的测定原理，复习用DNS比色法测定还原糖的方法。2淀粉水解糖含量定量分析

2.1实验目的

3,5－二硝基水杨酸法（DNS法）定糖原理：在NaOH和丙三醇存在下，3,5－二硝基水杨酸（DNS）与还原糖共热后被还原生成氨基化合物。在过量的NaOH碱性溶液中此化合物呈桔红色，在540nm波长处有最大吸收，在一定的浓度范围内，还原糖的量与光吸收值呈线性关系，利用比色法可测定样品中的含糖量。

2.2实验原理

3,5－二硝基水杨酸（DNS）试剂；葡萄糖标准溶液（2.0mg/mL），6mol/LHCl，碘－碘化钾溶液，6mol/LNaOH，1%酚酞指示剂等18mm×180mm试管，移液管10mL，50mL三角瓶，滴管，白瓷板，250mL容量瓶，100~1000μL移液枪，蓝色枪头盒等恒温水浴锅，分光光度计等

2.3实验材料与设备1、葡萄糖标准曲线制作

分别配制0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mg/mL的葡萄糖标准溶液1mL，分别加入DNS试剂2.0mL，于沸水浴中加热2min进行显色，取出后用流动水迅速冷却，各加入蒸馏水9.0mL，摇匀，在540nm波长处测定吸光值OD540。（每组在此次实验过程中用同一支移液枪）测定前各台仪器均用蒸馏水调零，然后再测各管样液的吸光值。根据显色颜色由浅到深测定。在测定过程中请不要按自动校零键。注意分光光度计的规范操作。2.4实验步骤2.4实验步骤管号葡萄糖标准液（mL）蒸馏水(mL)葡萄糖含量(mg/mL)OD5401和2010

3和40.20.80.4

5和60.40.60.8

7和80.60.41.2

9和100.80.21.6

11和12102以葡萄糖含量（mg/mL）为横坐标，吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。用Excel绘制葡萄糖标准曲线，显示方程和R平方值。2、糖化液中含糖量的测定

在测糖化液还原糖之前，先做预实验确定合适的稀释倍数（稀释倍数参考值：500倍)。注意取糖化液前要充分摇匀。具体操作步骤详见讲义。

2.4实验步骤糖化液还原糖非还原糖DNS法测定2.4实验步骤在测糖化液总糖