肿瘤免疫细胞治疗平台及CART技术的建立(临床重点项目计划书)

临床学科重点项目计划书项目名称：肿瘤免疫细胞治疗平台及CAR-T技术的建立资助金额：万元科室（单位：血液科项目负责人：项目负责人联系电话：项目负责人手机：项目负责人电子信箱：执行年限年1月1年月31一、项目组人员情况序号 姓名 职称 出生日期 学位1 主任医师 博士2 教/主任医师 博士3 研究员 博士4 主治医师 硕士5 助理研究员 博士6 助理研究员 博士7 助理研究员 硕士18 主治医师 学士9 主治医师 博士10 主治医师 硕士11 师 士12 师 士13 师 士14 师 士15 员 士16 师 士17 师 士、介2近年来淋巴瘤的发病率逐年上升已超过所有血液恶性肿瘤的总和占恶性血液病之首淋巴瘤已成为一个威胁国民健康的重要病种其类型较多异质性较强侵袭性亦不同随着化疗体系的完善和靶向新药的应用淋巴瘤的疗效显著提高，已达到%以上，但其中有部分患者仍会耐药或复发，成为目前治疗的难点和重点。免疫细胞治疗是肿瘤生物治疗中重要的发展方向自体免疫细胞治疗技术是指从自体外周血中分离的单个核细胞经过体外激活和扩增达到一定数量后回输患者体内以发挥其直接杀伤肿瘤细胞和病毒感染细胞的作用调节机体免疫功能的作。嵌抗原体修饰T（cner,T）技体对与T淋胞能，特别并瘤力T，美国的临床研究显示对很大一部分B淋巴细胞复发难治的白血病患者可以起到很好的疗效，是肿瘤治疗领域的革命，本研究组也2例难治复发B细胞淋巴瘤患者中应用了CAR-T治疗，取得了较好疗效。该治疗策略临床风险较小，对患者疗效较好可延长患者无病生存时间降低患者复发率明显改善患者的生活质量。与传统的化疗比较，该疗法对患者毒副作用小，患者易于接受。近年国际血液、肿瘤界免疫治疗相关研究非常活跃，但CAR-T技术仍在探索中国际仅部分肿瘤中心在进行临床试验尚未普遍开展我国在这方面刚刚起步且在淋巴瘤治疗中尚未见报道如果我们能够抓住这一契机开展CAR-T治疗将可明显改善难治复发淋巴瘤患者的治疗效果使更多的患者从中受益，并可使我院的淋巴瘤免疫治疗居国内领先地位，提高医院及科室声誉和经济效益。3报告正文三、立项依据目前淋巴瘤的发病率在所有恶性血液病中居首位，近年来我国淋巴瘤的发病率也逐年上升由于淋巴瘤现在已成为可以治愈的肿瘤60以上患者经规范化治疗可长期生存，但本病类型较多、异质性较强，侵袭性亦不同，难治、复发疾病的疗临医临难针其同、及后，索、规化疗案者有意。发家，国T细胞巴、高恶性淋巴瘤、侵袭性淋巴瘤及结外非霍奇金淋巴瘤的发病率高，因此我国淋巴瘤预后不良的亚型较多，临床表现为难治性及侵袭性临床过程，预后较差。常规化疗近期疗效尚可，但远期生存率低，预后不良，需进一步研究患者的预后相关因素，并探索新的治疗策略。免疫细胞治疗因其是只针对肿瘤细胞进行的特异性治疗，对正常组织损伤较小，逐渐成为一种全新的有希望的治疗模式。目前针对淋巴瘤的免疫治疗有了很多进展和突破，近几十年人们一直尝试采用免疫学方法治疗肿瘤，如输注异基因（rlymphocyteinfusionDL（cl疫苗。树突状细胞疫苗用于肿瘤免疫治疗包括如肽、蛋白、肿瘤细胞及提取物的体外致敏，肿瘤相关抗原T）、RNA或细胞因子的基因转移，与肿瘤细胞形成融合细胞等。目前，细胞免疫治疗己经成为肿瘤生物治疗中重要的发展方向，包括淋巴因子激活杀伤细胞(LAK、浸润肿瘤淋巴细胞(T)、CD3单抗激活的杀伤细胞(CD3AK)和细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokineinducedkiller,CIK)等。同时针对乙肝病毒V。饰T细胞(chmeicanignecptrTcl,ART)是近年受体迅速发展的肿瘤过继免疫治疗新手段是将识别肿瘤相关抗原的单链抗（scFv）和T细胞受体TCR复合体的CD3ξ胞内激活结构域结合为一体即将抗体对肿瘤抗原的高亲和性与T淋巴细胞杀伤能相合使其有特性识并杀肿瘤细的能，同也可刺激内T细胞增。CAR-T技术自提后至前共有3第1代T胞4的胞内区增加了1-2个共刺激信号结构域，根据修饰分子的多少及类型分为第2代和第3代CAR-T第个刺信为CD28或4第2个共刺激信号可能有CD27CD284-BB,ICS或OX0体T逆达As，此C-T治疗可现对疾病长期制，者体可几年均检到CART的CART表达框架在人体染色体基因组的随机插入，仍存在着对重要功能基因的不确定影响（如增强、阻断、突变、癌变等），故其潜在的临床应用安全性和副作用仍然是阻碍这一方法未来广泛普及的障碍。表达框架的安全精确定点插入，是解决这一问题的关键。2011年美国Dr.June研究小组《新英格兰医学杂志上发表了应用T（clymphocyticleukemia,L研这项工作中他们尝试治疗了3例复发难治的成年白血病患者其中2例完全缓解并保持至今2013年12月，美国液年会闻发会道全共治疗了59例复发难白血患者其中24名获得了全缓。2014年10月，Dr.June报告了新治的30例复发治白病者中有27例达完全解，完全解率达90%。CART技术独特的作用机制和惊人的治疗效果使人们切实地领悟到基因工程修饰的T细胞方法―CAR-T细胞治疗诸多方法中威力最强、前景最好的方法，是肿瘤治疗领域的一次革命。血液科在医院的大力支持下，较早开展了血液肿瘤及部分实体瘤的细胞治疗，前期已有成熟的DK细胞治疗经验，而且已经在2例难治复发弥漫大B细胞淋巴瘤患者中应用了CAR-T治疗取，反也显一应。CT细反指的T细是C-T细必需益放（CRS）是常见且最突出的毒副反应，是由细胞因子激增所致的炎症过程，包括流感样症状、血管渗漏和多器官功能衰竭所致的低血压等。研究表明，患者不论肿瘤负荷高低均会出现程度不等的CRS表现，目前较高的肿瘤负荷是唯一明确的预测严重5CRS较CP而水的需的临床数据来验证。目前我科已经开展了患者的免疫功能全套检测，可以对患者的免疫细胞及细胞因子进行治疗前后的监测，在预防CRS中具有重要临床义。因此，本题拟依我院的床干细中心，行如下作1、立疫细胞疗台血科疫胞疗程2立规KDC+CIKBK等细操3发B淋巴患评其情免功并者行CART免疫治疗监其疫，对者行及估以价CART免疫细治疗的效及全。四、项内题（一研究目标. 程. 级CT制台. 代CAR-T技术的应用（二）研究内容1. 免疫细胞治疗技术1) 细胞毒性T（CT/（DC细胞50-70ml，离心后在我院P实培养CTL及DC细胞，分2-3回至者内。2) 过继性NK免疫细胞治疗血细胞分离机分离患者外周淋巴细胞50-70ml，离在院GMP实验培养NK细，分2-3回患体。2. 建标化理系1）GMP实验室准操程建立62）完善细胞培养的SOP保证标准化生产3）人员培训：临床医师及实验室工作人员的培训3. 质量控制1）细胞数量、成分、活性的质量控制2）微生物及病原体的控制4. 建立临床级CAR-T细胞制备技术平台1）筛选CD19淋巴瘤患者2）进行10-20例CART细胞治疗5. 进行CRISR联合CAR-T规T具用CRISPR技术可以做到精确点插入目基因。（三）拟解决的关键问题1、选难发B细胞淋巴瘤患者，进行第三代CAR-T免疫细胞治疗；2、在CAR-T免疫细胞治疗前后检测患者各种免疫细胞及细胞因子，并评价这些指标在预测细胞因子风暴CRS）严程度的用；3、建立常规CT、DC+CTL等细胞治疗及细胞培养标准操作流程；建立我院免疫细胞治疗平台，规范血液科免疫细胞治疗流程。7。研究方案行10例复发难治白血病病人的自体T细胞治疗。患者签署细估T的估T。（一）入选标准：1）符合以下条件的CD19阳性的白血病患者：①符合以下条件的ALL患：不异胞条于限异胞的。②以的CLL者:I过2；I最后一次化疗与疾病进展间隔不足1年的；I。2龄18-60岁；3）预计存期3个月至2年；4）自体植患者无论其前经过样的治，复发都是合条件；5采；6。（二）排除标准：具备下述排除标准中任何一项的患者不能入选本试验：1）具有癫痫病史或其他中枢神经系统疾病者；2）具有移植物抗宿主反应，需要使用免疫抑制剂者；3）既往有QT期长心病；4）或期本对生的性知；5）愈活染：86）活动性乙型肝炎或丙型肝炎病毒感染者；7前2周并物使固醇；8）治；9）T制效于3%，答CD3/CD28共刺激信号时扩增能力不足（5；0）酐>2.m/l或T/3倍正常量或胆红素>2.0gdl者；1；2；3）CNS中枢神经系统受累的白血病患者；14）研究者认为可能增加受试者危险性或干扰试验结果的任何情况。（三）剔除标准：受试者符合以下任何一项标准的，将提前退出试验：1.受试者要求退出试验；2.严重违背方案；3.发生不良事件，研究者判断需要终止试验的情况，包括：NCIT>3级症状；细胞注24周内的任时发可能很能确定本究关实验毒性和临床事件，包括但不限于输注毒性和任何可能与T细胞有关的任何毒性，如浸；.；.的T的T；.。（四）治疗方案1．细胞治疗前的化疗方案：天进行以保障19CART细胞能够在化疗结束天后输注。化疗的目的是减少淋巴细胞数量，以促进19CRAT细胞的移植和稳定的扩增。9化疗也是为了减小肿瘤负荷CART（CRS概细必治：第432续3（fludarabine注射剂量为25~30mg/m2/da；输注前第2天: 同时静脉注射环磷酰（cycloposphmide量为90g/m2/da；2．病人CART细胞回输方案：根据美国已有的文献报道CAR修饰的T量为1x105~1x107细胞/公斤体重。本研究参照此范围，并根据收集到的病人T。：1x105~1x107细胞/公斤体重输注式：用分输注。第一次输注过程分3天进行。第0天按照输注剂量的10将T细胞经静脉缓慢输注入病人体内输注过程约持续30分钟第1天按照输注剂量的30，第2天按照输注剂量的60进行输注；输注后严密监控病人是否有临床并发病症对于有足够的CT用无第1。3（CRS）应对策略根据美国临床试验的文献发现，由于T常，大量的细胞因子会在短时间内被释放到血液中，病人在T细胞回输后的第7~14天可能发生细胞因子释放综合CRS即所谓的细胞因子风暴T细胞治疗后发生细胞因子风暴的概率和严重程度与肿瘤负荷正相关。细胞因子风暴的直接临床表现为发热。我们拟采用在美国同类临床研究中被证明有效的抗白介-6R抗体Tociluzuma（8mg/kg）来控制细胞因子释放综合征CRS，时情合皮质类激素配治。4．细胞耗竭的应对方案10由于正常B细胞也具有CD19抗原所以T击CD19阳性的肿瘤细胞时会同时攻击CD19阳性的正常B细胞可能使B细胞耗竭而发生低丙球蛋白球（G。5的T细胞扩增对案T细胞的扩增可能不受正常的体内正常的平衡机制控制。美国临床前研究表明T对9中T能对肿瘤细胞或正常B细胞产生的信号有反应而增殖。这可能是有益的也可能是有害的取决于T。，T占细生T，可干。（五）观察项目与时点、试验流程1．安全性观察项目标：；；实、B；（NCICTC.0标准。2．疗性测目疫）。3点1第1录MRD髓和/结血及T。2第。113）受试者在回输后年内，按照每3个月一次进行评估。4）受试者在回输后的年内，按照每年一次进行评估。（六）疗效评定标准根据以上观测结果，进行疗效判定：①以肿瘤细胞比例变化作为疗效的主要标准（治愈情况；②临床症状改善情况；③治后生存期（生存率；④肿瘤无进展时间；⑤生活质量评价；⑥免疫功能评价；⑦毒性反应（不良反应）评价。（七）统计方法：1、患者入组及分析人群描述例。2析。3析的毒性评估根据NC一般毒性标准4.版分级。停止后30天内PD死亡的不需要报，PD死亡的PD住院的不需要报。4、疗效分析受试者接收19CART细胞输注后随访时或受试者需要替代治疗时，医生判定疗效检CT免（）等。（八）试验的质量控制与保证办12者及临床监查员均应严格按照P据。（九）进行R联合CAR-T技础究常规CAT方案基因插入具有随意性，而应用CRISPR技术可以做到精确定点插入目的基因，完成2-3例患者础究。可行性分析我在院大支下开了CTLC了0的经。本研究的细胞制备拟在我院临床干细胞中心进行，我院临床干细胞研究中心成立于2006年占地面积约500平米目前主要由2个GMP车间科研区及各自的附属区构成GMP车间及附属区因功能不同而分别达到B级C级洁净度，可以满足临床级细胞移植时制备细胞的要求科研区及附属区配置有先进的能够快速分选干细胞的流式细胞分选仪、全自动化的免疫组织化学染色成像系统、尼康共聚焦成像显微镜、定量PCR仪等各实仪器床细中心以本目开免细制究提良好的作台。13六、项目组成员的人才培养计划：本究题临方可一对巴免细治其是T疗心P实验室可立免细胞疗完整的作流及规，为院其科室疫细治疗提参考据。本研究培养士研生1-2人硕究生2-3。七、项目预期目标1、项目解决的关键问题以及预期达到的水平（限500字）（国际领先、国际先进、国内领先或填补院内空白）1、选择难治复发B细胞淋巴瘤患者，进行第三代CAR-T免疫细胞疗，价CART免疫细胞治的有性及全性国际先；2在CART免疫细胞治前后测患者种免细