中药质量标准分析方法的验证

1中药质量标准分析方法的验证2中药质量标准分析方法的验证?中药方法学验证的特点?反映被测成分与辅料间的影响与试验操作误差?反映测定全过程误差的总和,特别包括其中提取、分离、转化反应等前处理过程所带来的误差?由于中药所含成分复杂、含量偏低，试验步骤较多，测定难度会更大，对精密度等影响会更大，一般难以达到常见的如化学药品的要求，且随着含量的高低和分离步骤的多少，可达到的要求会不同3验证的目的?证明采用的方法是否适合于相应的检测方法?新建立的检测方法、改变原检测方法、工艺变更、处方变更等均须验证验证过程和结果均应记载在标准起草或修订说明中4需验证的分析方法类型?鉴别?限量检查?含量测定?溶出度、释放度?需控制的残留物、添加物等5需验证的分析方法类型检查

验证项目

鉴别

定量

限度

含量测定

准确度

-+-+重复性

-+-+中间精密度

-+①

-+①

精密度

重现性②

++++专属性③

++++检测限

--+-定量限

-+--线性

-+-+耐用性

++++范围

-+-+

①已有重现性验证，不需验证中间精密度。②重现性只有在该分析方法将被法定标准采用时做。③如一种方法不够专属，可用其他分析方法予以补充。6准确度(Accuracy)系指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度，有时也称真实度，一般用回收率(%)表示。以经典方法的测定值作为真值，建立方法的测定数据与之比较（该法适用于化学单体药物）以加入对照品测定的回收率表示，一般有空白回收（制剂空白）和加样回收测定的方法（中药材、复方制剂等）7准确度试验方法?同一样品，制备相同浓度的6份样品（样品取样量减半，以1：1比例加入对照品）?同一样品，制备3个浓度的供试品，每个浓度分别制备3份供试液，共9份，对照品的加入有以下3种方式：8准确度?取相同量样品9份（一般为样品取样量的一半），设计3个浓度，按不同比例加入对照品。中间浓度一般按1：1比例加入，低、高浓度可选0.5：1、1.5：1的比例。加入的对照品的量要适当，保证供试品溶液的浓度（或量）在考察的线性范围内。?取3个不同量的样品各3份，每个取样量分别按1︰1比例加入对照品，中间浓度应选定在正常测定浓度，其他两个浓度可以结合范围考察的最高、最低点进行测定。?按标示量计算的组分，可参照化学药品测定方法，取9份样品，按0.8：1、1：1、1：1.2的比例加入对照品（样品取样量减半）。9准确度报告的数据：样品中待测成分含有量对照品加入量测定量回收率计算值（%）相对标准偏差（RSD%）10准确度测定数据的精度要求?一般应满足以下规定回收率（%）95～105％相对标准偏差（RSD%）TLCS＜5%，HPLC/GC＜3%11准确度感冒清热颗粒中葛根素含量测定－回收率1编号样品含量(mg)加入葛根素的量(mg)测得葛根素总量(mg)回收率(%)平均回收率(%)RSD(%)18819301853104.5297.223.712877178597.633875176495.594884176794.955883177395.76878176194.9512准确度感冒清热颗粒中葛根素含量测定－回收率2编号样品含量(mg)加入葛根素的量(mg)测得葛根素总量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%522877930178597.6399.254.713875176495.597881134198.928882465134098.4997.71.799883132895.710885224097.13118841395225498.2197.510.6212881223797.2将序号1-3,7-12进行统计分析，结果平均回收率为98.15，RSD=2.65%。13准确度感冒清热颗粒中葛根素含量测定－回收率3编号样品含量(mg)加入葛根素的量(mg)测得葛根素总量回收率(%)平均回收率(%)RSD(%522877930178597.6399.254.713875176495.591322845396.981422823245396.9897.991.7815229461100161322265695.631713211395264094.5595.030.58181319264394.91将序号1-3，13-18进行统计分析，结果平均回收率为97.42，RSD=3.13%。143种回收率试验方法比较1、同量同加2、同量异加3、异量同加97.2298.1597.423.712.653.13020406080100120123回收率RSD%15精密度（Precision）精密度系指在规定的测试条件下，同一个均匀供试品，经多次取样测定所得结果之间的接近程度(离散程度)精密度可以从三个层次考虑：重复性(Repeatability)中间精密度(Intermediateprecision)重现性(Reproducibility)?精密度考察应使用均匀稳定的、可信的样品。如果得不到，可用人为配制的样品进行研究。16重复性(Repeatability)重复性:在相同操作条件下，由同一个分析人员在较短的间隔时间内测定所得结果的精密度17重复性?实验要求：在规定范围内，取同一浓度的样品，用6个测定结果进行评价；或设3个不同浓度9份样品，用9个测定结果进行评价（高低浓度可以结合范围的考察设计，中间浓度为样品平均浓度，计算9份样品的相对标准偏差）18重复性?测定数据的精度要求一般应满足以下规定相对标准偏差(RSD%)TLCS＜5%，HPLC/GC＜3%。19重复性生丹颗粒中补骨脂素测定－重复性1取样量（mg）补骨脂素量（mg）含量(mg/g）含量平均值(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（％）5.00540.31150.062230.063350.063250.6320.370.32270.064475.00660.31890.063700.062980.31170.062265.01440.31790.063400.063480.31870.063565.00660.31770.063460.063480.31790.063505.00380.31570.063090.063270.31750.063455.01450.31660.063140.062950.31470.0627620生丹颗粒中补骨脂素测定－重复性2取样量（mg）补骨脂素量（mg）含量(mg/g）含量平均值(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（％）2.50780.15090.060170.060030.061860.6192.820.15020.059892.50420.14720.058780.058700.14680.058622.50260.15140.060500.060460.15120.060425.00540.31150.062230.063350.32270.064475.00660.31890.063700.062980.31170.062265.01440.31790.063400.063480.31870.063567.50200.45700.060920.061630.46770.062347.50240.47480.063290.062840.46810.062397.51020.48080.064020.063260.46950.0625121生丹颗粒中补骨脂素测定︱重复性3取样量（mg）补骨脂素量（mg）含量(mg/g）含量平均值(mg/g）平均值(mg/g）含量（mg/袋）RSD（％）1.25710.07810.062130.062010.064530.6454.000.07780.061891.25000.07820.062560.062080.07700.061601.25940.08050.063920.063880.08040.063845.00540.31150.062230.063350.32270.064475.00660.31890.063700.062980.31170.062265.01440.31790.063400.063480.31870.0635612.46280.83090.066670.067830.85980.0689912.64540.84530.066850.065860.82030.0648712.42530.84770.068220.069330.87520.07044223种重复性试验方法比较评价方法补骨脂素含量（mg/g）RSD（%）6份0.063250.379份0.061862.829份0.064534.00AVERAGE（mg/g）0.06321RSD（%）2.11?结果表明九份不同浓度的RSD高于六份同浓度的RSD。23中间精密度在同一个实验室，不同时间由不同分析人员,用不同设备测定结果之间的精密度，称为中间精密度考察的目的：考察随机变动因素对精密度的影响考察的变动因素:不同时间不同分析人员不同设备至少3人采用同一设备或同一人采用3台不同设备，对同一批样品测定含量。计算不同操作者或不同设备测定的含量平均值和相对标准偏差。不能仅考察不同分析时间的结果，有重现性考察的，可以免做中间精密度。24重现性(Reproducibility)在不同实验室由不同分析人员、不同设备测定结果之间的精密度?考察的目的：当分析方法将被法定标准采用时，应进行重现性试验?目前阶段，该项试验可采用起草和复核试验的测定数据进行评价。但应由起草单位根据复核所的复核数据，报送两个实验室之间的相对标准偏差?由于中药有些被测成分属于痕迹量的,因此两个或两个以上实验室测定结果的偏差允许范围目前尚难确定25专属性（Specificity）?系指在一些可能存在的其他成分（包括杂质、降解物、基质等）存在时，采用的方法能准确可靠测定出药材、饮片、提取物及中药制剂中被测成分的能力?一种分析方法缺乏专属性时，可由其他辅助的分析方法作补充26专属性?专属性有以下含义?鉴别：确证被测物是否符合其特性?检查：确保采用的分析方法可检出被测物中杂质或应控制物的准确含量，如有关物质、有毒成分、重金属、溶剂残留量等?含量测定：提供样品中被测物含量的准确结果27专属性?鉴别应能与可能共存的物质或结构相似化合物区分。不含被测成分的供试品，以及结构相似或组分中的有关化合物，均不得干扰测定显微鉴别、色谱光谱鉴别等应附相应的代表性图象或图谱。28专属性?含量测定和限量检查色谱法和其他分析方法，应附代表性图谱，以不含被测成分的供试品（除去含待测成分药材或不含待测成分的模拟复方）试验说明方法的专属性。并标明相关成分在图中的位置，色谱法中的分离度应符合要求。必要时可采用二极管阵列检测或质谱检测进行验证29专属性Minutes02468101214161820mAU0255075100mAU0255075100

10969

53958

5179

26454

10260

5265(Geniposide)

8100

3007

8284

45991:238nm,8nm?????\?NameHeightMinutes02468101214161820mAU0255075100mAU0255075100

43627

9341

26599Geniposide

851601:238nm,8nm?????\?5-Rep2NameHeight安宫降压丸中栀子苷含量测定：上图为栀子苷对照品下图为缺栀子的空白阴性对照溶液30专属性常用的试验方法?空白阴性对照试验?比较同一分析系统对照品与供试品相应色谱峰的吸收光谱的一致性?色谱-质谱联用验证待测成分31空白阴性对照试验的试验要求?TLC：目测观察，空白阴性对照应不得显与供试品检测成分相应的斑点。?HPLC/GC/TLCS：空白阴性对照色谱中，在与相应对照品保留时间相应的位置应无色谱峰或其峰面积小于5%32空白阴性对照试验?除去待测药味，按规定的制法制成空白样品，按测定方法同法制备空白阴性对照溶液?测定成分为2种以上药材含有的，应分别制备每一药味的空白，及减去含有共同成分药味制备的空白33检测限检测限系指供试品中被测物能被检出的最低量试验方法采用已知浓度的对照品进行试验?直观法如薄层色谱检测成分的检出量或毒性成分检出限量的确定。在薄层板上，以已知浓度的对照品点样，依法展开、显色后目测观察，可检出的最小量为检测限。?仪器法（信噪比法）信噪比（S/N）为3：1的样品的浓度（或量）。以已知浓度（或量）的对照品溶液进样，峰高值为3倍噪音时的对照品浓度为检测限。噪音的测量，可以空白溶剂进样，记录相应长度的色谱基线，测量相当于对照品保留时间前后适当距离的噪音高度即可。34定量限（LimitofQuantitative,LOQ）定量限系指供试品中被测成分能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。试验方法：一般以10倍于噪音的对照品溶液重复点样或进样5-6次，计算重复点样或进样的峰面积值的RSD%。当RSD%＜3%（薄层扫描法）或＜2%（高效液相色谱法/气相色谱法）的浓度（或量）为方法的定量限。若RSD%较大，应重新调整对照品溶液的浓度，进行测定。35线性（Linearity）线性系指在设计的范围内，测试结果与供试品中被测物浓度直接呈正比关系的程度。36线性:试验方法?制备梯度浓度对照品溶液，以相同体积点样或进样测定峰面积值，制备标准曲线，并以峰面积值与对照品浓度（或量）作线性回归，计算线性方程和相关系数?制备同一浓度的对照品溶液，以不同体积点样或进样测定，同法处理?线性测定的浓度应尽量在一较宽的范围，至少应大于范围中的高低限浓度区间?计算相关系数，要求：TLCS：R＞0.99，HPLC-UV：R＞0.999，HPLC-ELSD：R＞0.99537范围?范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间?考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围?验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次数等38范围范围系指能达到一定精密度、准确度和线性，测试方法适用的高低限浓度或量的区间考察的区间应尽可能覆盖日后样品可能的含量范围验证试验过程中除取样量和进样量可改变外，一般不得改动实验操作过程中规定的如溶剂体积、提取时间、萃取次数等。39范围可结合准确度试验进行，并以高、低限浓度的精密度进行评价。一般可在准确度试验的高低两个浓度点各加测3份样品，分别计算高、低浓度点6份样品的RSD%值，并满足以下规定TLCS法RSD%＜5%，HPLC/GC法RSD%＜3%。40范围（单体药物）实验项目限度范围含量测定标示量90-110%80-120%杂质检查限度值限度值的50-120%溶出度限度值限度值的±20%含量均匀度测试浓度测试浓度的70-130%41范围（中药和复方制剂）?含量限度有上下限的，一般设定范围低限为含量限度下限的50～70％，范围的高限为含量限度上限的130～150％。?含量限度仅有低限的，一般设定范围为含量限度的50％～70％至含量限度的2～5倍以上。?以标示量规定含量限度的，可参照化学药，一般设定范围为标示量的80％～120％。42耐用性?耐用性系指在测定条件有小的变动时，测定结果不受影响的承受程度，为把方法用于常规检验提供依据?经试验，应说明小的变动能否通过设计的系统适用性试验，以确保方法有效?开始研究分析方法时，就应考虑其耐用性。如果测试条件要求苛刻，则应在方法中写明明43耐用性典型的变动因素被测溶液的稳定性样品提取方式时间44供试品溶液制备方法选择?提取条件的确定,应对不同溶剂、不同提取方式、不同时间及不同温度等条件进行比较，确定最佳条件，并提供研究数据。选择合适的提取方法将被测成分最大限度地从制剂样品中提取出来，再选用一定的纯化方法将其与干扰测定的杂质分离，制成供测定用的供试品溶液45典型的变动因素（液相色谱法）?不同品牌或不同批号的同类型色谱柱（至少采用3根不同商品规格的色谱柱，测定同一批样品溶液的含量，计算含量值和RSD%。应提供不同柱分离的色谱图，计算理论板数、分离度和拖尾因子，并分别计算样品的含量和柱间的相对标准偏差）?流动相的组成比例的变化?流动相pH值的变化?柱温?检测波长?样品溶液稳定性（一般不得少于6小时，计算不同时间测定的峰面积平均值和RSD%，一般不得过2%）46典型的变动因素（气相色谱法）?不同品牌或批号的色谱柱?固定相?不同类型的担体?柱温，进样口和检测器温度等47典型的变动因素（薄层色谱法）考察主要检测成分的分离情况?不同品牌的薄层板?点样方式?薄层展开时温度（至少考察低温4-10℃和室温的分离情况）?薄层展开时相对湿度（至少考察高湿75%相对湿度和低湿20%相对湿度的分离情况）可根据实际情况增加考察项目48耐用性试验示例安宫将压丸中栀子苷测定－提取条件选择表1提取方法及提取溶剂及溶剂量的比较

方法

栀子苷含量(mg/g)甲醇超声提取

1.635380%甲醇超声提取

1.6307甲醇加热回流提取

1.6330加硅藻土分散，甲醇超声提取

1.605725ml甲醇超声提取

1.635350ml甲醇超声提取

1.6396

选择50ml甲醇超声提取49耐用性试验示例安宫将压丸中栀子苷测定－提取条件选择表2提取时间比较

超声提取时间(分钟)栀子苷含量(mg/g)201.6146301.6307401.6353选择50ml甲醇超声提取40分钟50耐用性试验示例薄层鉴别清咽润喉丸中玄参的鉴别－湿度变化的影响相对湿度58％相对湿度88％51人参TLC图（26℃、10℃）52黄连生物碱TLC（预平衡的影响）苯－醋酸乙酯－甲醇－异丙醇－浓氨试液（6:3:11.5:0.5）53苍术正己烷提取物的TLC54厚朴的TLC（RH需在85%以上）55讨论?参照国际通行方法，<中药质量标准分析验证指导原则>对中药质量标准的规范化研究提出了较为完善的要求，对药典标准、新药质量标准的起草、修订的工作有重要的指导作用?<指导原则>对分析方法验证的项目内容、实验方法和数据要求更为规范和严格?<指导原则>收载了ICH分析方法验证的全部项目56讨论影响评价方法结果的因素所测成分的含量高低？供试品的处理方法？其他因素？所测成分的理化