丹参鉴定学专论课件

9/24/2023中药鉴定学专论丹参分子生药研究9/24/2023一、丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别二、丹参分子基因组的分析及构建三、不同产地丹参分子生药基因组的分析四、高质量的丹参叶片DNA的提取方法研究9/24/2023第一局部：丹参的传统鉴别方法与分子生药鉴别。9/24/20231丹参形态学鉴别植物学特性鉴别传统方法大多根据丹参的形态方面对药材的真伪进行鉴别。丹参为多年生草本,根砖红色,茎高40~80cm,多分枝,被长柔毛。叶常为奇数羽状复叶。叶柄长1~7cm,小叶3~7,顶端小叶较大。小叶卵形或椭圆状卵形。长1.5~8cm,宽0.8~5cm,先端钝,边缘具圆锯齿,两面被柔毛,下面较密,花序顶生或腋生轮伞花序有花6至多花,组成假总状花序,密被腺毛及长柔毛;小苞片披针形;花萼钟状,长1~1.3cm,先端二唇形,萼筒喉部密被白色柔毛;花冠蓝紫色,二唇形,长2~2.7cm,花冠筒外伸,弯曲,上长达2cm,筒内有毛环;雄蕊2,药隔长,花丝短,上臂药室发育,2下臂的药室不育且联合;小坚果4,椭圆形,花期5~8月,果期8~9月。9/24/2023丹参形态9/24/2023丹参药材根部性状丹参药材根部性状鉴别丹参及其亲缘种类的药用植物甚多,以根部特征区别各类丹参也是沿用很久的经典方法。丹参根的特征为:丹参多为带根茎的根,根茎粗短,有茎基剩余,下着生多数细长的根。根呈圆柱形,稍弯曲,外表呈砖红色,粗糙,具多数纵沟或皱纹,有须根痕,外部栓皮常鳞片状剥落,皮层有时开裂,长8~22cm,直径5~12mm,质坚脆,易折断,断面不平,疏松有裂隙,皮部棕渴色或砖红色,韧皮部狭。形成层明显,淡棕色,木质部导管束灰黄色或黄白色,放射状排列。气微,味微苦、涩,以条粗壮、色紫红者为佳。9/24/2023丹参药材根部形态9/24/2023水试鉴别法：用水浸泡丹参根的方法对丹参进行鉴别,正品丹参根浸泡后的溶液无色,药材稍膨胀,颜色稍微变浅。伪品丹参溶液显红色药材变为淡红色。水浸后续断会被染成红色,粉末中有草酸钙簇晶;丹参水浸不染成红色,粉末中无草酸钙簇晶,但有石细胞及红棕色物为丹参。从而将两者进行区分。9/24/2023显微结构鉴别根的横切面显微结构鉴别根粉末的显微结构鉴别花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别9/24/2023根的横切面显微结构鉴别根据丹参横切面显微结构特征与紫丹参进行区分,丹参(SalviamiltiorrhizaBge.)木栓层3~7列,木栓细胞长方形,切向延长,壁非木化或微木化;外侧有时可见落皮层。皮层窄,纤维单个散在或2~6个成群,孔沟放射状,层纹细密。韧皮部较窄,由筛管群和薄壁细胞组成。形成层明显成环。木质部宽广,4~12mm呈放射状排列。有些相邻的束在内侧合并,导管类圆形或多角形,有的沿径向延长,直径15~65mm,单个散在或2~12个成群,径向排列或切向排列;木纤维兴旺,多成群分布于大导管周围;有的本质部束内有1~2群木化薄壁细胞;木射线宽广,射线细胞多木质化增厚。紫丹参根茎表皮细胞1列,内含紫红色物质;皮质薄壁细胞有的具纹孔;髓部薄壁细胞壁呈连珠状增厚或稍增厚,具纹孔。根本质部束常较小,导管也少。9/24/2023根粉末的显微结构鉴别丹参粉末呈红棕色。木栓细胞黄棕色,外表观呈类方形或多角形,壁稍厚,胞腔内常含红棕色色素,色素溶解后,断面观细胞类长方形,排列较整齐。木纤维多成束,长梭形,纹孔斜裂缝状或十字状,孔沟稀。导管主要为网纹和具斜纹孔导管。石细胞呈类圆形、类三角形、类梭形、类长方形或不规那么形,也有延长呈纤维状,有的胞腔内含棕色。9/24/2023花粉形态学特征对丹参及同属药用植物的鉴别一定的植物具有一定形态的花粉,因此花粉形态研究也是植物分类鉴别的依据之一。丹参的花粉以外壁较薄、纹饰网眼较浅、网脊较粗、沟较宽、沟底具颗粒而区别于其他种。9/24/2023理化学方法鉴别根据丹参所含的化学成分进行鉴别经过大量分析研究说明丹参所含化学成分中二萜醌成分与系统发育有密切关系,二萜醌类化合物组成的不同可以作为种类鉴别的依据,根据二萜醌成分含量的多少对丹参组作丹参的药用植物的亲缘关系进行划分。9/24/2023薄层色谱鉴别采用薄层色谱定性鉴别的方法比较后指出在同一展开系统的条件下,无论是野生还是栽培品种,丹参的一些主要成分相同,以此可以作为识别丹参药材真伪的参考依据。9/24/2023紫外吸收光谱鉴别丹参在253,277nm两处有吸收特征峰,而甘西鼠尾在264,248,218,203nm4处有吸收特征峰。作丹参使用的药材紫外吸收光谱的范围不同,据此可以对两者进行鉴别。丹参粉末处理后置紫外灯(365nm)下现察显亮蓝灰色荧光。9/24/2023指纹图谱鉴别(HPLC法)具有色谱稳定性好、柱效高、应用范围广等特点,是中药指纹图谱研究中常用的手段。对丹参等几种中药指纹图谱与代谢指纹图谱研究的结果,指出不同产地的药材在指纹图谱上存在较大差异。9/24/2023分子生物学鉴别方法1RAPD鉴别法：随机扩增的多态性DNA(RAPD)技术已经被广泛应用于物种鉴别。2DNA遗传标记技术随着分子生物学和基因工程技术的日趋成熟,从遗传DNA分子水平检测生物遗传多样性并进行分类与鉴定已成为可能。DNA分子遗传标记技术具有快速、微量、特异性强的特点,且不受生长发育阶段、供试部位、环境条件的影响,已在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景,并保持强劲的开展势。9/24/2023第二局部丹参分子基因组的分析及构建9/24/20231丹参主要居群DNA指纹图谱的建立2丹参EST序列中SSR信息的分析及建立9/24/2023丹参主要居群DNA指纹图谱的建立基因组DNA的提取编号名称来源花颜色Al大叶丹参四川中江紫色A2商洛丹参陕西商洛紫色A3首县紫花丹参山东芭县紫色A4四倍体丹参中国药科大学紫色A5芭县白花丹参山东芭县紫色A6北京丹参中国中医药研究院紫色A7毫州丹参安徽亳州紫色A8丙城丹参山西茵城紫色A9江苏丹参江苏射阳紫色A10小叶丹参四川中江紫色A11安国丹参河北安国紫色A12甘西鼠尾草甘肃紫色A13一串红陕西省杂交油菜研究中心红色A14油菜陕西省杂交油菜研究中心黄色A15小麦陕西省杂交油菜研究中心注:Al一Al，为各居群编号，以下同。9/24/2023RAPD一PCR扩增反响体系及扩增程序的优化别设计M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度等单因子试验，同时保持扩增体系的其它成分浓度及扩增程序其它环节不变，以优化、确证适宜的M扩+、Taq酶、模板DNA的浓度及退火温度。9/24/2023鉴别丹参与其近缘和远缘植物的特征引物及其DNA指纹图谱引物s2035、s222扩增结果不仅稳定、条带明亮，而且采用引物s2035、s232建立的指纹图谱丹参主产区的n个居群丹参的PCR扩增带型几乎相同(1一n泳道)，其中有200一1100bp的七条共同的特异条带，即图6的条带Cl、CZ、C3、C4、图7的CS、C6、C7，各丹参居群完全相同。9/24/2023结果验证：结果验证显示，PCR扩增重复性较好，取样合理，能够代表各居群。9/24/2023丹参EST序列中SSR信息的分析及建立丹参EST序列中SSR信息的分析微卫星〔Microsatellite〕又称简单重复序列(Simplesequencerepeat)，指的是基因组中由1～6个核苷酸组成的根本单位重复屡次构成的一段DNA，广泛分布于基因组的不同位置，长度一般在200bp以下SsR分子标记具有数量丰富，多性高，多等位基因，共显性，重复性高等优点。根据建立SSR标记的序列性质不同可分为基因组SSR〔GenomicSSR,gSSR〕和表达序列标签SSR〔ExpressedsequencetagSSR，EST-SSR〕。EST及表达序列标签是通过从cDNA文库中随机挑选的克隆进行大规模测序所获得的5’或3’端序列，长度一般在150~500bp。9/24/2023丹参EST-SSR引物情况表引物编号重复基元GeneBankEST编号预期产物bp引物序列退火温度〔℃〕SSR001

(TACA)5

CV172410

241

GAGGCTACTTCGTGGAGG

52.3GAAACTAAAGCAACAAACCC

52.1SSR002

(CA)16

CV172134

176

CCGTGGTGTTCCCTCTTT

55TGCCGATTCTAACCTGTATG

53.7SSR003

(CT)10

CV171877

137

AGAGGCTGCTGCTTCATT

52.7TCAAGTCATAGGCGTGGC

54.5SSR004

(AAC)6

CV171649

222

AGGCAGACAGACCTCATA

46.7CTTCCCACCAAATAACTC

46.8SSR005

(GTG)6

CV171565

153

CTCAGCACCTACTACCACAT

49.6CTTATCCCAACACTTCTTCT

48.5SSR006

(ATC)5

CV171563

155AAACAGAGCGACGAAGCAG

56.29/24/2023ACCACCATCACTCAAGACG56.4SSR007(CTT)11FE537066165CTCCGCTTCGCTCCTCTT57.7TGCTCGCTTCGTCGTCTT57.2SSR008(GCT)6FE536370181AGGTTACTACCGATGAAGCAG54.1AGTTGAGTGGTGATGGAAGAT53.2SSR009(AAG)6FE536230145GACTTTGGATGCCTGCTC52.9GACGCCGCTACTTTCTAT50.2SSR010(TATGC)5FE536872136AATAAGGCAATACAGGGTC49.2CTTTACACGCATAACACG47.4SSR011(TC)18FE536561162AACTTGGCAATGTTCGCTAT55.2GCTTGTTCTTGACAGGCTTC54.9SSR012(TC)8tatct(AC)8FE536456161GGTCCATTCCTCTTATTTCC52.9GCCATCAAGTGGTCGTCT55.6SSR013(AGC)6FE536096162CAGTCCAACAGCCCGACCAG63.4ATCATCATCGCCAGCATCCC62.4从NCBI数据库下载鼠尾草属EST序列11747条，其中包括丹参EST序列10228条和Salviafruti－cosa1519条，应用对含有SSR的序列进行搜索。搜索参数设置为：单核苷酸、二核苷酸、三核苷酸、四核苷酸、五核苷酸和六核苷酸最少重复次数分别为18次、6次、5次、4次、4次、3次9/24/2023丹参的EST-SSR分布频率与特点丹参EST-SSR中共包含77种重复基元。单核苷酸重复有1种A/T。二核苷酸重复也为3种，以AG/CT为主，占64.21%。三核苷酸重复为10种

丹参EST-SSR信息情况表重复类型基元种数SSR数占全部SSR比例出现频率单核苷酸重复1106953.0810.45二核苷酸重复338018.873.72三核苷酸重复1045022.344.40四核苷酸重复6150.740.15五核苷酸重复9130.650.13六核苷酸重复48874.320.85总计772021100.0019.699/24/2023丹参二、三核苷酸重复基元情况表重复类型基元数量占该类型比例出现频率单核苷酸重复A/T

1069

100.00

10.45二核苷酸重复AC/GT

60

15.79

0.59

AG/CT

244

64.21

2.39AT/AT

76

20.00

0.74三核苷酸重复AAC/GTT

8

1.78

0.08AAG/CTT

79

17.56

0.77AAT/ATT

9

2.00

0.02ACC/GGT

14

3.11

0.03ACG/CTG

123

27.33

1.20ACT/ATG

41

9.11

0.40AGC/CGT

36

8.00

0.35AGG/CCT

25

5.56

0.24AGT/ATC

95

21.11

0.93CCG/CGG

20

4.44

0.209/24/2023第三局部不同产地丹参分子生药基因组的分析9/24/2023不同产地丹参遗传关系的DNA标记分析利用RAPD与ISSR标记对不同产地的野生与栽培丹参的遗传变异进行分析,以期为丹参药材的引种栽培与科学选育提供科学依据。不同产地丹参野生与栽培药材RAPD与ISSR标记的遗传变异药材取样个体多态条带数多态条带比率基因多样性原产地P(%)指数(Ht)栽培药材S-AHBZ82221.570.075安徽亳州

S-SXYC

8

21

20.59

0.0708山西运城

S-JSBH598.820.0361江苏滨海

S-SCZJ51312.750.0518四川中江

S-JSSY843.920.0129江苏射阳

S-JSRG61514.710.0474江苏如杲物种水平408785.290.1934野生药材S-SDYS376.860.0314

山东沂水

S-SD3113.570.0078

山东

S-SDPY21211.760.0439

山东平邑

S-SX21716.670.0675

陕西物种水平106260.780.1738总计509795.100.23899/24/2023结论：不同产地丹参的遗传分化根据POPGENE计算不同产地丹参间Nei无偏遗传距离与遗传一致性见表3。10个产地的丹参间,产自山西运城的丹参(S-SXYC)与来自江苏滨海的丹参(S-JSBH)的遗传距离最小,为0.0996;而来自山西运城的丹参(S-SXYC)与来自山东的丹参(S-SD)的遗传距离最大,为0.3777;遗传一致性正好与遗传距离相反,遗传距离最小的两个产地的丹参,遗传一致性表现的最大,S-SXYC与S-JSBH之间的遗传一致性最大,为0.9052,说明它们之间的亲缘关系最近。江苏3个产地居群的遗传一致性介于0.8267与0.8389之间,平均0.8339;山东3个产地的丹参遗传一致性介于0.6898与0.8088之间,平均0.7597,说明不同产地的丹参间存在明显的遗传分化。9/24/2023第四局部高质量的丹参叶片DNA的提取方法研究9/24/2023材料和方法样品的采集及预处2004年7月~9月份在泰山采集白花丹参的成熟叶片,凉干保存1个月。试剂和仪器1试剂CTAB(上海生工),Vc(北京鼎国),SDS(上海生工),PVP(上海生工),β-mercap-toethanol(上海生工),Taq酶(Takara),AFLPcorereagentkit(invitrogen,CatNo1084-016)。2仪器PTC-100基因扩增仪(MJ公司),Al-legraTM64Rcentrifuge(BECKMAN)离心机,DNA离心真空枯燥器(Savant),EC-600-90(E-Cappara-tuscorporation)高压电泳仪9/24/2023方法改进CTAB法:用常规CTAB法作为根本方法,添加一些抗氧化剂和提高CTAB的比例。处理A:提取液中加Vc干粉末30mg(1·5mg/mg叶片)。处理B(PVP预洗法):加PVP粉末(干叶量的10%),与干叶共同在液氮下研碎。参加4℃预冷的CTAB-freebuffer(0·2MTris-clpH8·0,0·05MEDTA,0·25MNaCl,内含4%β-mercaptoethanol),冰上放置10min,7000rpm(不能太高,否那么膜破,DNA损失),4℃,离心10min,弃上清。然后加Vc干粉末(1mg/mg干叶片)于4×CTAB