乳蛋白水解液中多肽含量的快速测定

乳蛋白水解液中多肽含量的快速测定

牛奶蛋白是优良动物蛋白的来源。乳蛋白在酶的作用下降解,可释放出很多具有功能性的短肽,如二肽、三肽,其吸收的速度比同一组成的氨基酸快。目前已从发酵乳中分离出具有功能性的短肽,如抗高血压肽(VPP和IPP)。因此,来源于蛋白质水解的肽成为当今研究的热门课题之一。在水解蛋白质的过程中,控制蛋白质的水解程度,尽可能少地产生氨基酸,尽可能多地得到目标产物多肽,是水解的根本目的。这就要求建立一种能快速测定水解液中多肽含量的有效方法。对于测定蛋白质水解程度有多种方法,三氯乙酸法是常用的一种方法,它是利用三氯乙酸沉淀水解液中的大分子蛋白质,继而以微量凯氏定氮法测定上清液中可溶性氮的含量,然后减去水解之前样品溶液中可溶性氮的含量,再与样品中的总氮量相比,从而确定其水解程度。此法中微量凯氏定氮法测定的是水解液中可溶性总氮的含量,若改用双缩脲法,便可测定其中含2个(包括2个)以上肽键的多肽的含量。本文利用10%的三氯乙酸沉淀样品水解液中的大分子蛋白质,经离心过滤后,在上清液中加入双缩脲试剂,于310nm测定其OD值,继而在谷胱甘肽三肽标准曲线上查出样品中的多肽含量。从而建立了一种快速测定乳蛋白水解液中多肽含量的有效方法。1材料和方法1.1实验室、标准品米曲霉:陕西科技大学生命科学与工程学院生物实验室;鲜牛乳:市售;谷胱甘肽标准品:北京奥科生物技术有限责任公司;CuSO4·5H2O、三氯乙酸等:分析纯。1.2仪器和水浴锅UV-2600型紫外可见分光光度计:尤尼柯(上海)分析仪器公司;LD5-2A型低速离心机:常州国华电器有限公司;HH-2型超级恒温水浴锅:上海浦东物理光学仪器厂;BS224S型电子分析天平:北京赛多利斯天平有限公司;1.3测量1.3.1吸收光谱法的测定取2mg/mL谷胱甘肽标准溶液1mL,加入双缩脲试剂,在300~800nm范围内扫描,得到其吸收光谱曲线。1.3.2空白样的测定取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,分别加入2、3、4、5、6mL双缩脲试剂,定容至10mL,分别做空白样对照,测OD值。1.3.3空白样的测定取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,加入双缩脲试剂,定容至10mL,放在30、40、50、60、70℃水浴5min,分别做空白样对照,测OD值。1.3.4空白对照研究取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,加入双缩脲试剂,定容至10mL,放在25、30、35℃水浴锅中,分别做空白对照,测OD值。1.3.5固相前后双缩哌试剂法取2.5mL样品溶液,加入2.5mL10%(w/v)的三氯乙酸(TCA)水溶液,于漩涡混合仪上混合均匀,静置20min,然后在3500r/min下离心10min。然后取1.0mL上述溶液置一试管中,加入双缩脲试剂3.0mL(样液∶双缩脲试剂=3∶2,v/v),于漩涡混合仪上混合均匀,60℃水浴显色5min,2000r/min离心10min。取上清液于310nm下测定OD值,对照标准曲线求得样品溶液中的多肽浓度C(mg/mL),进而可求得样品中多肽含量。2结果与讨论2.1围内扫描结果将GSH标准品用双缩脲试剂显色,在300~800nm范围内扫描。结果见图1。由图1知,最大吸收波长在585nm和310nm处,在310nm处时最大吸收波长是0.187,585nm处为0.097,所以选310nm波长为测定波长。2.2双缩蝽试剂加量优化取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,分别加入2、3、4、5、6mL双缩脲试剂,定容至10mL,OD值随双缩脲试剂加量变化情况见图2。由图2可知,可能由于随加入量的增多体积变大使标样浓度降低,所以OD值反而下降。加入量为3mL双缩脲试剂为最好,试剂与标样反应充分。2.3温度对od值的影响取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,加入3mL双缩脲试剂,定容至10mL,放在30、40、50、60、70℃水浴5min,OD值随温度变化情况见图3。由图3可知,温度对反应速率的影响比较显著,反应的速率常数随温度的升高而很快增大。在60℃时为最高,高于60℃,温度对反应速率有抑制作用。故60℃水浴为最好。2.4双缩蝽试剂对od值的影响取1mg/mL的谷胱甘肽的标准溶液1mL,加入3mL双缩脲试剂,定容至10mL,放在25、30、35℃水浴锅中,OD值随室温变化情况见图4。由图4可知,60℃水浴后放置在室温25~35℃范围内OD值几乎无变化,稳定时间为80min。2.5固相色谱法测定od取谷胱甘肽标准溶液(0.8mg/mL),依次吸取上述溶液0、1、2、3、4、5mL置于6支试管中,分别加3mL双缩脲试剂,用蒸馏水定容至10mL,60℃水浴显色5min,水浴期间不停地振荡,然后冷却至室温(25~35℃),于310nm下测定OD值(以第1管做空白对照)。以肽浓度为横坐标X(mg/mL),OD值为纵坐标Y,制作标准曲线(图5),得到回归方程y=0.3789x+0.0024,R2=0.9966。2.6甘肽三肽溶液的测定配制0.28mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按程序测定其中多肽含量。实验重复3次,取平均值,结果见表1,回收率为92.8%~100%。2.7精密度和标准偏差配制0.4mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按相同程序进行3轮平行测定,以检验测定程序的精密度,结果见表2。精密度Sw=(∑Si2/n)1/2为0.0208(n为测定轮数),标准偏差Cv=((Sw/x)×100)(x为测定平均值)为5.3%,平均值为0.39mg/mL。注:xi1和xi2为平行测定值,Si2为方差。3在乳液中，对氨基乙酸钠的分析3.1甘肽三肽水溶液成分配测定用鲜乳配制2mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按标准程序测定其中多肽含量。实验重复3次,结果见表3,回收率为92.5%~102.5%。3.2方法的精密度配制2mg/mL的谷胱甘肽三肽水溶液,按相同程序进行3轮平行测定,以检验测定程序的精密度,结果见表4。精密度Sw=(∑Si2/n)1/2为0.0938(n为测定轮数),标准偏差Cv=((Sw/x)×100)(x为测定平均值)为4.78%,平均值为1.96mg/mL。注:xi1和xi2为平行测定值,Si2为方差。3.3米曲霉的水解量取50mL灭菌鲜乳,然后加入粗酶液10mL(酶液制备:灭菌的鲜乳30mL,米曲霉接种量6%,温度28℃,转速180r/min,培养6d)于温度45℃、自然pH下进行水解。每隔1d