放射毛霉脂肪酶在防腐剂发酵过程中的酶学特性

放射毛霉脂肪酶在防腐剂发酵过程中的酶学特性

优雅辐射（39.27）是一种昵称为跳跃烧灼物的药物。这是中国现在腐败植物创造中最常见的一种。腐乳在前期培菌的过程中,毛霉分泌了大量的蛋白酶和脂肪酶。在后期发酵过程中这些酶作用于腐乳坯体的脂肪、蛋白质等大分子物质,使之发生降解与酯化成香的化学变化,形成了腐乳独特的色、香、味。其中,腐乳的香气主要来自于后期发酵过程中形成的大量酯类物质,有研究者推测,在生产过程的前期由脂肪水解而生成游离脂肪酸,在最终阶段醇与酸发生酯化作用,从而生成大量的乙酯类物质。近来,人们对于腐乳的研究主要集中在菌种的选育,多菌种混合发酵,试图改进腐乳的生产工艺。然而,由于对腐乳酿造中参与酶系的特性的研究,腐乳后酵的生化过程的研究几乎空白,使得腐乳的品质和风味难以有较大的改进。在此背景下,本文结合腐乳生产实际,研究了雅致放射毛霉胞外脂肪酶的酶学特性,分析了腐乳发酵过程中与脂肪酸水解有关的指标,以探讨腐乳在发酵过程中脂肪的动态变化,为将来进一步研究打下基础。1材料和方法1.1马铃薯培养方法雅致放射毛霉Actinomucorelegans3.27,上海工业微生物研究所,接种在马铃薯培养液中,接种量为0.5%,培养条件:160r/min摇床培养,48h。1.2实验方法1.2.1接种、发酵、接种、发酵大豆→浸泡→磨浆→煮浆→点浆(盐卤)→压榨→划块→白坯→接种(雅致放射毛霉)→毛坯→搓毛→腌制(NaCl≈12%)→盐坯→盐水清洗→灌汤装瓶→后期发酵(30~40d)→腐乳1.2.2关于优雅辐射酶脂肪酶特性的研究1.2.2.mol/minml指发酵原液体积用于雅致放射毛霉酶学特性研究:直接以发酵原液进行测定。单位为μmol/(min·mL)(mL指发酵原液体积);用于腐乳后期发酵过程中脂肪酶活力测定:2倍腐乳样品质量的0.15mol/L氯化钠溶液,4000r/min下冷冻离心5min后的粗酶液。1.2.2.2.脂肪酶活力的测定1.2.2.3-脂肪酶最佳ph值40℃,在不同的pH值磷酸盐缓冲液(0.02mol/L)条件下测定雅致放射毛霉脂肪酶的酶活。1.2.2.4-脂肪酶的最佳反应温度1.2.2.5脂肪酶的ph稳定将酶液分别置于不同pH的缓冲液中,4℃放置24h后,调节至最适pH,再测定其剩余酶活。1.2.2.6脂肪酶的稳态1.2.2.7.氯化钠浓度对酶活性的影响配制不同浓度的NaCl底物反应液,于pH7和40℃的条件下,分别测定脂肪酶活力。1.2.3优雅辐射毛酶腐的理化工程1.2.3.1.取样白坯取5块,毛坯取5块,腌坯取5块,腐乳后酵阶段,分别取5、10、15、20、30、40d的坯体和汤料样品(4∶1),混合均匀。1.2.3.2.ph测量1.2..31.2.3.4.脂肪试验2结果与讨论2.1关于优雅辐射酶脂肪酶的性质研究2.1.1ph对脂肪酶活力的影响酶的最适pH指酶表现出最大活力的pH。酶分子上有许多酸性、碱性氨基酸的侧链基团,随pH的变化处于不同的解离状态,从而直接影响酶的活性。如图1所示,雅致放射毛霉脂肪酶在中性环境中(pH7左右)表现出较高的活力,在碱性环境中表现出的脂肪酶活力高于酸性环境中,在pH低于6.8的弱酸性环境下,随着pH的下降,脂肪酶的相对酶活急剧下降,表明该酶对弱酸性环境很不稳定。从图1中可以看出,缓冲液pH范围在6.8~7.5之间,脂肪酶较为稳定,24h后水解活力保持在85%以上。在酸性条件下其稳定性较差,在pH为5.8时,脂肪酶活力只有30%左右。pH大于7.5时,脂肪酶的稳定性呈现逐渐下降的趋势。由此表明,雅致放射毛霉脂肪酶在中性偏碱性的条件下具有较好的稳定性。在后面的测定雅致放射毛霉脂肪酶活力时,均取最适pH=7.0。2.1.2不同温度对立地条件下毛霉脂肪酶活力的影响温度对酶活力的影响有两个方面:当温度升高时,反应速率也随之提高,但是,当温度上升超过某一界限时,促使酶蛋白变性,使得酶活力丧失的速率也加快。从图2可以看出,雅致放射毛霉脂肪酶在40~50℃温度范围内具有较高的酶活力,在40℃时酶活力表现最高,随着作用温度升高和降低,酶活力均呈现出减弱的趋势。图2所示,雅致放射毛霉脂肪酶在25~40℃温度变化范围内,随着保温温度的增加,相对酶活力也不断增加,40℃以后酶活力则不断下降,当温度达到60℃以上,脂肪酶的活力下降到10%左右,该脂肪酶在40~50℃之间呈现出良好的热稳定性。肖春玲报道了毛霉M2脂肪酶的酶最适温度为50℃,在50~60℃温度范围内脂肪酶活力较为稳定,可见毛霉脂肪酶是一种较耐中高温的酶类。2.1.3nacl浓度对脂肪酶活力的影响在40℃,pH7.0条件下,比较了不同浓度的NaCl对维持脂肪酶活性的作用,结果表明(图3),NaCl浓度为0.15mol/L时,脂肪酶活力最高,为0.41U/mL。随着NaCl浓度的增加,脂肪酶活力表现出逐渐减少的趋势。前期培菌过程中使用12%(≈0.22mol/L)的氯化钠进行腌制,从图中可以看出,该浓度对脂肪酶活力有一定的抑制作用(此时脂肪酶活力为0.32U/mL)。2.2关于优雅辐射后裔的遗传因素在发酵过程中的脂肪酶活性和脂肪水分解水的变化2.2.1盐坯和盐坯对脂肪酶活力的影响如图4所示,白坯中的脂肪酶活力很低(主要来自于原材料中大豆本身存在的脂肪酶),毛坯阶段的脂肪酶活力最高,为0.60U/mL,而盐坯阶段脂肪酶活力有所下降,为0.39U/mL。表明自白坯接种到毛坯,雅致放射毛霉在此阶段产生了大量的脂肪酶。盐坯(NaCl腌制)比毛坯的脂肪酶活力低,可能是由于此时的pH为7.46呈现出偏碱性,该pH条件下脂肪酶活力不稳定(图1)。同时因为在盐坯的腌制过程中,直接添加了相当于毛坯重量12%(0.22mol/L)的NaCl进行腌制,图3显示该浓度对于脂肪酶活力有一定的抑制作用。腐乳后期发酵过程中脂肪酶活力变化如图5所示,随着后期发酵时间增加,脂肪酶活力基本呈现不断下降的趋势。这可能是因为在后期发酵过程中腐乳的pH低于6.8,且持续下降(图5,第5d的pH为6.71,第10d的pH为6.66,第15d的pH为6.63,到第40d的pH为6.53),而图1中脂肪酶稳定性的结果表明,在该pH范围内脂肪酶很不稳定。图5中可以看到,在20~25d的后酵阶段,脂肪酶活力有很小的增加,与鲁绯报道的脂肪酶活力在整个发酵过程中表现出的极其不稳定的结论不同,同样,与全名海报道的腐乳后期发酵的过程中脂肪酶活力有所增加也不相同,同时,我们用其他测定酶活力的方法进行了验证,均出现相同的趋势。我们推测可能是在此阶段其它参与发酵的微生物如乳酸菌分泌的脂肪酶所致。这一趋势在相关文献中未见报道,需要进一步的研究。2.2.2脂肪酶活力变化脂肪酸值是指脂肪中游离脂肪酸含量,酸价越高,表明脂肪水解程度越高。腐乳在前期培菌过程中的酸价变化见图6。图6的数据表明,黄豆研磨成豆浆至形成白坯阶段,其中脂肪的酸价为0.08以上,表明有一定量的游离脂肪酸产生,推测是由于原料中天然存在的脂肪水解酶的作用产生。在白坯接种成为毛坯的阶段,脂肪酸价仅有少量的升高(0.003mgKOH/100gfat),而图6表明在毛坯阶段脂肪酶活力最高。这可能是由于毛坯阶段尽管有大量的脂肪酶生成,但这些酶并未与坯体充分接触而发挥作用。从图6可以看出,腌坯阶段的酸价要远远大于毛坯阶段的酸价,表明水解主要发生在腌坯阶段,可能是经过搓毛,使脂肪水解酶与坯的接触增加,有利于脂肪水解作用的进行。腐乳在后期发酵过程中酸价的变化如图7所示。随着后期发酵的进行,腐乳的酸价也呈现出逐渐升高的态势。表明在整个后期发酵过程中,有越来越多的游离脂肪酸生成。2.2.3期ph的影响从图8以看出,腐乳后期发酵过程中pH呈现平稳而且缓慢下降的趋势,从发酵初期的中性到发酵末期pH=6.53呈酸性,可以推断出整个后期发酵的过程中产生了大量的酸,总酸的含量逐渐增多。这其中包括蛋白质经过蛋白酶的作用产生一些酸性氨基酸,同时脂肪被脂肪水解酶作用生成了游离脂肪酸和甘油(丙三醇)。本研究结果与马勇的报道大致相同,但鲁绯在报告中指出pH最终为6.2。2.2.4其他功能模量大豆中的脂类主要包括脂肪(甘油三酯)和一些类脂类物质,其中甘油三酯的含量占到95%,类脂类物质占5%。腐乳在前期培菌阶段和后酵阶段的脂肪含量分别如图9和图10所示。在前期培菌阶段,脂肪含量的变化并不大,在腌坯的时候,添加了大量食盐(毛坯重量的12%)后的脂肪含量为23.10%,如不将食盐的重量计算在内,脂肪含量=0.2310/0.87×100=26.53%,与毛坯含量相当,可见,在毛坯、盐坯制作过程中,脂肪含量变化很少,由此推断整个前期培菌过程中脂肪没有进行代谢作用。然而,在后期发酵的阶段,腐乳的脂肪含量呈现出下降的趋势。在后期发酵过程中游离脂肪酸经过各种代谢作用,变成了醛酮醇等化合物,按照本研究的脂肪含量测定方法,这些代谢产物不计入脂肪含量。从图10中可以看出,第5~20d发酵过程中的脂肪含量下降趋势相对于第20~40d的发酵阶段较为明显,这与马勇报道的大致相同。3发酵温度对脂肪酶活力的影响雅致放射毛霉脂肪酶最适温度为40℃,最适pH为7.0,最适盐浓度为0.15mol/L。在整个发酵过程中,毛坯阶段的脂肪酶活力最高,为0.60U/mL,盐坯阶段脂肪酶活力有所下降,为0.39U/mL。在腐乳后期发酵过程中,脂肪酶活力与脂肪含量变化趋势大致相同,基本都呈现出随着发酵时间的增加,脂肪酶活力与脂肪含量不断减小的趋势。然而,在第20~25d后酵阶段,脂肪酶活力出现小幅度的增加,原因不明确,有待于进一步的研究。pH随着后期发酵的进行呈现出下降的趋势,而