高温前酵与不同前酵条件下毛霉、根霉复合酿造防腐剂的比较研究

高温前酵与不同前酵条件下毛霉、根霉复合酿造防腐剂的比较研究

生产周期分为前发酵和后发酵。前发酵是细菌生长、分泌和积累酶系统的过程，并从腐败中获得毛囊。毛霉是腐乳主要生产用菌,由于其高温耐受性差,导致在炎热季节生产的腐乳质量不佳。通过对酶系活力及感官性状的跟踪检测,发现在高温环境下采用雅致放射毛霉与米根霉混合酿造腐乳在前酵阶段生长良好。风味是衡量腐乳质量的重要参照。腐乳后酵阶段各种成分的变化和参与发酵菌种有着密切关系。在腐乳的后酵阶段,坯体中的大分子物质在由微生物所分泌的大量酶系的作用下,降解成小分子成分,从而提高产品的营养和风味。通过对比高温前酵条件下混菌、单菌酿造的腐乳在后酵阶段的主要化学组分、感官评价的变化进行测定,并对后酵阶段坯体中蛋白质降解情况及产品风味成分进行分析,从而完成对高温下腐乳风味化学组分的研究,为指导高温生产环境下混菌腐乳的实际生产提供一定理论依据。1材料和方法1.1致放射性毛霉ciccrend与米根霉cicc397的复合酿造腐乳毛坯:在35℃高温前酵条件下,分别由雅致放射毛霉(CICC3118)与米根霉(CICC3037)以1∶1比例复合酿造,雅致放射毛霉(CICC3118)单菌酿造。1.2试剂与试剂厂SDS试剂盒康为世纪;低分子量标准蛋白,十二烷基硫酸钠(SDS)、Tris-HCl、考马斯亮蓝R250宝生物工程(大连)公司;超低分子量标准蛋白北京索莱宝科技有限公司;硝酸银国防科技工业应用化学一级计量站;甲醛重庆川江化学试剂厂;溴酚蓝上海常必鑫贸易有限公司;硼酸成都市科龙化工试剂厂;巯基乙醇天津市光复精细化工研究所。1.3洪纪仪器设备79-1磁力加热搅拌器金坛市富华仪器有限公司;ATN-300全自动定氮仪上海洪纪仪器设备有限公司;YCZ-24DN垂直电泳槽北京六一仪器厂;HP6890/5975CGC/MS联用仪美国安捷伦公司;2cm-50/30μmDVB/CAR/PDMS手动固相微萃取装置美国Supelco公司。1.4测试方法1.4.1工艺1.4.2主要检测项目和方法氨基酸态氮的测定:甲醛滴定法;食盐的测定:AgNO3滴定法;水溶性蛋白的测定:半微量凯氏定氮法;可溶性无盐固形物的测定。1.4.3腐败后的情绪评估品评步骤按照文献进行,结合行业标准中感官评定要求制定评分标准,见表1。1.4.4e凝胶的制备凝胶的制备:分离胶和浓度胶均按康为世纪SDS凝胶制备试剂盒说明配制,分离胶浓度分别为12%、20%,浓缩胶浓度为5%,板胶厚0.75mm。溶液配制、上样及电泳、固定和染色操作均参照相关文献进行。1.4.5保鲜条件及质谱分析样品处理:取样品约10g,置于50mL固相微萃取仪采样瓶中,插入装有2cm-50/30μmDVB/CAR/PDMSStableFlex纤维头的手动进样器,在85℃左右顶空萃取30min取出,快速移出萃取头并立即插入气相色谱仪进样口(温度250℃)中,热解析3min进样。分析条件:色谱柱为ZB-5MSi5%Phenyl-95%DiMethylpolysiloxane(30m×0.25mm×0.25μm)弹性石英毛细管柱,柱温45℃(保留2min),以5℃/min升温至280℃,保持2min;汽化室温度为250℃;载气为高纯He(99.999%);柱前压7.62psi,载气流量1.0mL/min;不分流进样;溶剂延迟时间:2.0min。质谱条件:采用EI源为离子源;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;电子能量70eV;发射电流34.6μA;倍增器电压1436V;接口温度280℃;质量范围20~450amu。检测方法:采用固相微萃取法和气相色谱-质谱联用法对腐乳风味物质进行检测。通过质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图,对总离子流图中的各峰进行分析,确定挥发性化学成分,并用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数。选取相对含量较大并有完整质谱数据的组分为分析对象。2结果与分析2.1自乳化阶段以来，主要化学成分的变化2.1.1乳酸发酵过程中氨基酸态氮含量的变化经高温前酵的单菌酿造腐乳、混菌酿造腐乳后酵第1周至第9周氨基酸含量变化情况见图1。由图1可知,在腐乳后酵阶段,两组样品的氨基酸态氮含量均有了不同程度的上升。混菌酿造腐乳的氨基酸态氮含量迅速增加,而单菌酿造腐乳的氨基酸态氮含量增速相对较平缓;这是因为在35℃前酵环境中,混菌酿造腐乳坯体上的菌体生长更为迅速茂密,所积累的蛋白酶的量与活力也更高。2.1.2其营养比的确定经高温前酵的单菌酿造腐乳、混菌酿造腐乳在后酵第1周至第9周水溶性蛋白含量变化情况见图2。由图2可知,随着前期发酵过程中豆腐坯上积累的酶系的作用,蛋白质的降解速度加快,水溶性蛋白质的含量快速上升;后酵进行到7~21天,水溶性蛋白质的含量增长迅速,但混菌酿造样品增幅更明显。后酵21~63天期间,单菌酿造腐乳与混菌酿造腐乳水溶性蛋白质含量相比增长较平缓。至63天,单菌酿造腐乳坯体与混菌酿造腐乳的水溶性蛋白含量分别达到10.8g,11.5g/100g。2.1.3可溶性无盐固对于混菌酿造乳酸发酵过程中混菌发酵经高温前酵的单菌酿造腐乳、混菌酿造腐乳在后酵第1~9周水溶性无盐固形物的变化情况见图3。由图3可知,在21天检测时两组的水溶性无盐固形物均出现了迅速下降的情况,这是由于在第14天检测时发现样品中食盐含量稍低,补加了食盐,导致了第21天检测时水溶性无盐固形物的骤减和第28天含量的骤增,之后增长速度变缓。此过程中混菌酿造腐乳的水溶性无盐固形物含量高于单菌酿造腐乳。水溶性无盐固形物含量的高低可以反映在发酵过程中有效营养成分的分解利用的情况,含量越高,蛋白质和淀粉的分解就越彻底,口感越柔软细腻,香味越好,营养成分也越高。2.2高温、高温下混菌酿造乳酸的评分通过后酵阶段每周对单菌酿造腐乳与混菌酿造腐乳样品进行感官品评,按照表2的评分要求分别对两组样品进行打分。由表2可知,在整个后酵阶段,高温下混菌酿造腐乳的评分一直高于高温下单菌酿造腐乳的评分。这与后酵阶段各主要化学组分的变化情况是吻合的。2.3感官、口感及细菌培养通过对后酵阶段各化学组分、感官评价进行对照,尽管在后酵63天两者的上述指标差别不太大,但混菌酿造腐乳的风味、口感及细腻程度明显优于单菌酿造腐乳。为此,进一步检测了两组样品在后酵阶段蛋白质的水解情况,并利用GC-MS测定了产品的风味物质。2.3.1不同发酵时间对混菌投资发酵乳酸中蛋白质的降解经历高温前酵过程的单菌酿造腐乳与混菌酿造腐乳分别在后酵3,6,9天及毛坯的SDS结果见图4。在豆腐坯体的后酵阶段中,菌体所分泌的蛋白酶对腐乳坯体中的蛋白质进行了水解。随着发酵时间的推移,大分子量的蛋白质被水解成小分子量的胨、肽及氨基酸。由图4可知,后酵3,6,9天两组样品的蛋白质降解程度,虽然两组样品中的蛋白质都有明显的降解现象,但混菌酿造腐乳中蛋白质水解更为迅速。至后酵9天,混菌酿造腐乳的蛋白质分子量基本已小于14.3kDa,但单菌酿造腐乳的蛋白质在14.3~20.1kDa范围内仍有明显条带。2.3.2小分子量物质分析高温下单菌酿造腐乳和高温下混菌酿造腐乳分别在后酵30,60天的SDS结果见图5。在后酵后期,随着成熟时间的延长,腐乳坯体中的蛋白质的水解程度增加,出现了大量的小分子量物质。由图5可知,在后酵阶段进行至30天时,单菌酿造腐乳样品在分子量为22.0kDa附近有明显条带,此时混菌酿造腐乳样品的分子量已经小于14.4kDa,说明混菌酿造腐乳的蛋白质在后酵后期降解更为迅速。在后酵进行至60天时,混菌酿造腐乳样品主要以分子量小于7.8kDa的形式存在,单菌酿造腐乳样品中物质的分子量在0~22.0kDa之间均有分布。表明在后酵后期,混菌酿造腐乳中的蛋白质降解为更小分子量的物质。2.4挥发性化学成分的种类使用气相色谱-质谱联用仪对经过9周后酵的高温下毛霉单菌酿造腐乳及混菌酿造腐乳产品中的风味成分进行分离,并以常温下单菌酿造腐乳做对比,得到GC-MS总离子图,分别见图6~图8。对总离子流图中的各峰经质谱计算机数据系统检索及核对Nist2005和Wiley275标准质谱图,确定出挥发性化学成分的种类,用峰面积归一化法测定了各化学成分的相对质量分数,分析结果见表3。各种酯类和醇类构成了腐乳的主要香气物质。由表3可知,高温下单菌酿造腐乳产品的风味物质33种,其中,醇类化合物5种,酯类化合物15种;高温下混菌酿造腐乳产品的风味物质43种,包括醇类化合物6种,酯类化合物18种;常温下单菌酿造腐乳产品的风味物质42种,主要有醇类化合物7种,酯类化合物12种。高温前酵条件下混菌酿造的腐乳中,风味物质种类明显多于高温前酵条件下单菌酿造腐乳;而与常温前酵条件下雅致放射毛霉单菌酿造腐乳相差不大。说明高温下混菌酿造腐乳的风味与常规生产的产品接近,但比同条件单菌酿造产品更丰富,这与化学组分的测定及感官评分的结果是一致的。3感官及风味变化经高温前酵的混菌及单菌酿造腐乳在后酵阶段主要化学组分、感官评价的变化情况都存在一定差异。至后酵63天,混菌酿造腐乳的氨基酸态氮高于单菌酿造的0.07g/100g,水溶性蛋白的含量高于0.7g/100g,水溶性无盐固形物的含量高于0.5g/100g。以色泽、香气、滋味、质地及组织形态为感官指标,混菌酿造腐乳的评分一直高于单菌酿造腐乳。对毛坯及后酵阶段的样品进行SDS电泳分析,发现至后酵60天,混菌酿造腐乳中蛋白质分子量主要集中在7.8kDa以下,而单菌酿造腐乳样品中物质在分子量0~22.0kDa之间均有存在。说明混菌酿造腐乳较单菌酿造腐乳的蛋白质降解得更快,这是混菌酿造腐乳质地口感更细腻的主要原因。对后酵9周的腐乳的