浅析人类基因组测序工作的利与弊

浅析人类基因组测序工作的利与弊

1986年，首席执行官和赫克提出了基于-对称法的基因组学。当时，它指的是对重组前后的规划、测量和分析。基因组学的研究发展包括两个部分:结构基因组学和功能基因组学。前者是对基因组分析的早期阶段,以建立生物的遗传、物理和转录图谱及其全序列测序为主;后者则是在前者的基础上系统地研究基因功能。然而,随着水稻基因组测序工作的完成以及人类基因组计划(HGP)的顺利进行,生命科学的研究已经进入了后基因组时代。目前的功能基因组研究主要包括以下几个方面:(1)全长cDNA克隆与测序;(2)获得DNA芯片等基因转录图谱;(3)突变体库的构建;(4)高通量的遗传转化鉴定系统;(5)生物信息技术平台与相应数据库的构建;(6)研究基因组表达的全部蛋白质及其相互作用为主要内容的蛋白质组学(Proteomlcs)。而针对这些研究内容所需的新技术已应运而生。1相关基因功能的研究微阵列(microarray)包括cDNA微阵列(cDNAmicroarray)和DNA芯片(DNAchips)。它是近年来发展起来的可用于大规模快速检测基因差别表达、基因组表达谱、DNA序列多态性、致病基因或疾病相关基因的一项新的基因功能研究技术。其基本原理是:将成千上万条DNA片段[1q`cDNA、表达序列标签(expressedsequencetag,EST)或特异性的寡核甘酸片段]按横行纵列有序地点样在固相支持物上,固相支持物为硝酸纤维膜或尼龙膜时,称为微阵列。把固相支持物改为指甲盖大小的玻片或硅片时所形成的微阵列就称为DNA芯片。检测时,首先以来自不同生理状态和发育阶段的mRNA为模板,以放射性同位素或荧光物标记的dNTP为底物反转录合成cDNA,再用合成出的cDNA与微阵列或DNA芯片进行杂交,然后通过计算机对结果进行判读和处理,就可以知道芯片上的哪些基因在细胞里表达,哪些基因不表达;同样也可以测知哪些基因的表达水平高,哪些基因的表达水平低。2基于sage的生物酶解为了大规模测定基因的表达,1992年Okubo等提出了基因表达的物理图谱的概念。其主要内容为:测定cDNA3′末端的部分序列,比较各种不同组织类型细胞中cDNA的种类和数量即构成基因表达的人体图谱(bodymap)。SAGE是同时、定量分析大量转录本的另一种方法。其基本原理是用锚定酶和位标酶两种限制性内切酶切割DNA分子的特定位置(靠近3′端),分离出短核苷酸序列(9~10bp),它包含了该转录本的足够信息。将一个体系的所有转录本中这一短序列分离并连接到一个克隆载体中进行测序,便可以得到该体系的所有转录本的表达情况。利用SAGE可以在短期内得到丰富的表达信息,与直接测定cDNA克隆序列方法相比,减少了大量的重复测序,从而大大节省了研究时间和费用。这种方法对正常、癌基因旁、癌组织中基因的差异表达研究方面还有独到的优点,有助于发现肿瘤特异基因。3rnai技术突变体的获得即构建突变体库是研究植物基因功能及生理代谢调控的一个重要前提。而抑制相关基因的表达则是在真核生物中获得突变体的有效途径之一。反义RNA和RNAi是抑制靶基因表达的两种代表性方法。反义RNA是能与靶RNA互补配对的小分子RNA,用来定点分析某一段DNA片断(基因)的功能。先分离该片断的mRNA,合成其mRNA的互补RNA即反义RNA,再加上启动子等表达必需元件,插入T-DNA,转化到植株中,合成的“基因”就会在植株中表达,表现出“性状”。反义RNA通过与靶RNA碱基配对的结合方式可在DNA复制水平、转录水平和翻译水平上参与基因表达调控。该技术最为突出的优点是能直接看到该基因在生物中的功能。然而将反义RNA以T-DNA转化到植株中,如果T-DNA插入到植物基因组中后影响其他基因的功能,则很难判断所表现出的性状是由那方面引起的。RNAi(RNAinterference)是真核生物体内由双链RNA(dsRNA)介导的生物细胞内同源基因的特异性沉默现象,并在秀丽线虫中发现证明属于转录后基因沉默。通过不断深入研究,RNAi的作用机制已逐步阐明。导入的dsRNA被RNAaseⅢ家族中特异性识别双链分子的Dicer酶切割成21~23nt的小分子干扰RNA(smallinterferingRNA)。然后,siRNA与一核酶复合物结合后形成RNA诱导沉默复合物(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC),并通过一个ATP供能的过程解双链。此时,激活的RISC在siRNA反应链的指导下与互补的mRNA结合,则靶RNA降解,翻译无法进行。RNAi较其他反求遗传学方法来说有四个重要特征:(1)转录后基因沉默;(2)RNAi具有很高的特异性,能够非常特异地只降解与之相应的单个内源基因的mRNA;(3)抑制效率非常高,能够达到基因缺失突变体的表型,而且有信号放大的可能;(4)抑制基因表达的效应能穿过细胞间隙,在不同细胞间长距离的传递和维持。由于RNAi的特异性抑制作用,该技术已经开始应用于人类疾病的治疗研究中并取得了一定的突破。加州大学洛杉矶分校和加州理工学院的研究人员开发出使用RNAi技术来阻止艾滋病病毒进入人体细胞。这个研究小组设计合成的1enti病毒载体引入siRNA,激发RNAi使其抑制了HIV-1的coreceptorCCR5进入人体外周血T淋巴细胞,而不影响另一种HIV-1主要的coreceptor-CXCR4,从而使以1enti病毒载体为媒介引导siRNA进入细胞内产生了免疫应答由此治疗HIV-1和其他病毒感染性疾病的可行性大大增加。4生物蛋白陷阱基因敲除主要用来基因修饰和分析基因功能。它是以同源重组为基础的功能基因组学方法。先构建一段外源DNA片断,该片断的两端与目的基因的两端序列相同,而中间序列被修饰片断代替,将该片断导人到细胞中,与目的基因发生同源重组,筛选出重组子,诱导出植株,在子代中分离出纯合子,就可以看到该基因突变后的表型。基因敲除作为功能基因组学方法,在动物小鼠以及酵母等中使用较为广泛,但在植物中仅在苔藓植物Physcomitrellapatens中使用得较为成功。到2001年为止,尽管在高等植物中做了大量的实验,但大部分都是不成功的,或至少是用常规途径是不可行的。基因陷阱主要指增强子陷阱(enhancertrap),启动子陷阱(promotertrap)和基因陷阱(genetrap)。增强子陷阱是将带有弱启动子的报告基因作为标签随机插入到基因组DNA中,如果恰好插在某个增强子附近,在该增强子作用下,报告基因表达。同时由于插入的标签序列已知,就可以使用PCR等方法将该增强子附近区域扩增出来,进行基因组学研究。启动子陷阱和基因陷阱是将一个无启动子的报告基因去随机插入到基因组DNA中,当报告基因插入到某一基因附近时,在该基因的启动子的作用下,就会转录产生融合转录物。在融合转录物中,报告基因的转译元件是正常的,可以转译蛋白。通过报告基因筛选转化子,使用标签序列对标签旁侧序列进行分析、对比,从而确定其性质。基因陷阱的最大优点是并不需要产生可见的突变来筛选突变子,只需报告基因的表达将转化子筛选出来,就可以通过已知序列的“标签”扩增旁侧序列。由于所使用的报告基因可以用来监视植物体内的基因表达模式,所以使用基因陷阱可以分离细胞或组织特异性表达和时序特异性表达基因。5组分析的步骤基因在生物整体的功能最终是由其编码的蛋白质在细胞水平上的体现。蛋白质组(proteome)的概念是Wasinger等于1994年提出,1997年,Humpherysmith等提出了一个与功能基因组学相对应的名词——功能蛋白质组学(functionalproteomics)。蛋白质组分析主要涉及两个步骤:蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。从基因表达的角度来看,蛋白质组的蛋白质数目总是少于基因组中的开放阅读框(ORF)的数目。从蛋白质修饰的角度来看,蛋白质组的蛋白质数目却多于其相应的ORF数目,因为mRNA的剪切和编辑可使一个ORF产生数种蛋白质,蛋白质翻译后的修饰,如糖基化、磷酸化同样增加蛋白质的种类,氨基酸序列一致的一级结构在一定条件下可以形成功能完全不一样的具有不同空间结构的蛋白质,如阮病毒。故蛋白质组内蛋白质数目要多于基因组内的基因数目,蛋白质组的概念也被定义为:在一种细胞内存在的全部蛋白质。基因组基本上是固定不变的,然而蛋白质组则是动态的,具有时空性和可调节性,蛋白质组学的研究能反映出特定基因的表达时间、表达量并为已测序的基因提供了大量的亚细胞定位、细胞和组织的分布、产物的修饰等相关的表达信息。所以蛋白质组学的研究是基因组DNA序列和基因功能之间的桥梁,有助于对基因组更深一步的了解并进一步阐明了基因的功能。6后基因组学的主要任务生物信息学(bioinformatics)是用数理和信息科学的观点、理论与方法去研究生命的现象,组织和分析呈指数增长的生物学数据的一门学科。它是以计算机为主要工具,研究DNA和蛋白质,运用各种软件,对日益增长的DNA和蛋白质序列以及结构进行收集、整理、储存、发布、提取、加工、分析等。生物信息学由数据库、计算机网络和应用软件三大部分组成。结构基因组学提供了巨大的DNA和蛋白质数据,功能基因组学的一个重要任务就是如何充分利用数据库去破译密码、预测蛋白质空间结构及其功能。通过同源性比较和比较基因组学(comparativegenomics)对基因功能的研究是后基因组时代生物信息学的主要任务之一。同源性比较是指将一段结构和功能未知的新DNA片段与数据库中结构或功能已知的序列(DNA或蛋白质)进行比对来推测整个基因或其中某一区段功能的过程。比较基因组学是通过模式生物基因组之间或模式生物基因组与人类基因组之间的比较与鉴别,来研究生物进化和分离人类遗传病候选基因以及新基因功能的学科。在人类基因组计划进行的同时,人们已对大肠杆茵(Escherichiacoli)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、秀丽新小杆线虫(Caenorhabditiselegans)、黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)和小鼠(Musmusculus)等5种模式生物的基因组进行了测序与分析,根据进化中“保守”基因的相似性和不同基因组中的基因排列的一致性,即基因的共线性(synteny,colinearity)就可以从这些模式生物中寻找人类可能具有的新基因。例如,人们从小鼠中发现了“胖鼠”基因后,通过遗传分析和物理作图,可获得“胖鼠”基因在小鼠基因中的位置,最后根据小鼠基因组与人类基因组的对应关系便可获得人类的“肥胖”基因。7功能基因组研究进展生命系统本身是一个自调节、与环境自适应的容错系统,同时也是一个复杂系统。对这种系统,一个基因的某些变化往往对整个系统性能影响是一定的,但几个基因共同作用则可能产生较严重的影响。要了解系统性能与基因的关系,就需要了解该系统的调节机理,也需要在总体上利用系统性能变化的数据进行建模。因此,我们需要在不同层次了解系统的调节机理,另外也需要在总体性能上进行数据采集,包括静态与动态的数据。综合两者,才能建立相应的系统模型对系统的性能变化进行分析与预测。因而国际上功能基因组研究正逐步向系统生物学研究的方向演化。1999年,LeroyHood专门组建完全采用系统学方式进行功能基因组研究的研究机构,技术方法采用大规模实验和多信息整合和建模方法。2001年5月在Science杂志发表体现功能基因组系统学鲜明特点的研究文章。该研究论文证明了整合基因组、蛋白质组和其它类型生物数据构建细胞的庞大的分子相互作用模型的威力和可行性;在很短的时间内对功能子系统酵母半乳糖的利用途径进行了系统分析,发现了许多以前需要很长时间才能得到的功能知识,还有许多用传统方法得不到的功能信息。生命系统是复杂的系统,深刻理解生命的分子机制,重要的是对涉及生命特定过程的所有基因和蛋白质的完整分析,需要充分利用基因和蛋白质各方面的信息以及细胞、组织和生物体水平的信息,获得对生物各个特定过程的整体功能信息和机制的认识。因此,功能基因组系统学的研究对象为各种层次的生物信息的复杂的相互作用,其中包括基因组DNA、mRNA、蛋白质、代谢产物、信号通路等等。其研究目标是了解基因组与生物体功能的关系,从而预防和治疗人体与动植物疾病。8调节rnai表达的调节就目前功能基因组学的发展形势来看,无论是应用于大量