线虫神经系统的分离

线虫神经系统的分离

自1968年brenner首次倡导并开始分离以来，j.w首次将昆虫神经系统的三维重建与遗传分析和形态研究相结合。在分子、细胞和一般水平上，我们探索了昆虫神经系统的发展和功能，并取得了许多关于其他动物的重要成就。1两种神经元间的结构型线虫神经系统结构很简单(Fig3)。两性成虫只有302个神经元;雄成虫由于支配尾交配器的需要,增加到381个神经元。这些神经元从形态上可分为118结构型。利用激光微束选择杀死一个或一组神经元可确定该神经元对整体行为的影响,从而鉴别其功能。用这一技术可把118神经元结构型在功能上分为40种类型。从形态上可鉴别的化学突触的数目有5000个,间隙连接有600个,神经肌肉接头有600个。2细胞编程死亡线虫是细胞定数动物。发育过程中产生的体细胞总数有1090个,其中131个细胞注定要按一定的发育程序陆续死亡。遗传分析发现细胞编程死亡是受两类基因控制的,ced-3和ced-4促进死亡,而ced-9则抑制死亡:从线虫基因序列出发,不久便找到了高等动物控制细胞编程死亡的同源基因,并深入研究了控制编程死亡的信号传递途径。现在已经知道动物体内细胞编程死亡是受其他细胞的信号控制的。生长中的神经纤维依赖靶细胞产生的营养因子(如NGF等)存活,它们通过对稀少的营养因子的竞争而自动调节存活的神经元的数目。细胞编程死亡在神经系统的形态发生、大脑皮质新旧构造的更替、神经通路的建立以及神经系统退行性疾病的发病机制中均起重要作用。目前这方面的研究受到很大重视,正方兴未艾。3egl-5基因突变线虫神经母细胞的决定和迁移受HX-C基因群的lin-39,mab-5,egl-5基因控制。Fig4a示lin-39(右斜线),mab-5(垂直线),egl-5(左斜线)基因突变影响的区域。当lin-39突变时,处于其影响区域的神经母细胞的发育命运改变为P1P1P1P1P1P9P9;mab-5突变时,处于其影响区域内的细胞改变为P6P6P2P2P2;egl-5突变时则P12改变为P11。mab-5基因不仅决定身体后段神经母细胞的发育命运,而且还影响通过此区域的细胞的迁移行为。当QL迁移到后区,启动细胞内mab-5表达,并控制该细胞的子细胞的迁移行为。当mab-5基因突变或表达异常时,QR衍生的子细胞的迁移方向从向前折到向后;而QL衍生的子细胞,则从向后折为向前(Fig4b)。线虫的5种运动神经元(VA,VB,VC,AS和VD)起源于10个前体细胞(腹神经索神经母细胞),其中每一个母细胞按相同谱系图式进行分裂,结果产生的神经元,按各自在前后轴上的不同位置而有不同的基因表达图式,从而决定了不同的分化类型。神经元的分化命运一方面受到lin-39和mab-5区域表达影响,另一方面还受到影响细胞谱系进行的unc-59和unc-85的影响。这些基因突变使有关细胞谱系的分裂受阻,结果不能产生原来应有的全部成熟神经元。一些细胞如处于适当位置可分化为VB或VC细胞,如位于其他位置则发生凋亡(Fig5)。成熟运动神经元的功能是受特定的基因表达图式规定的(Fig5)。细胞的各种基因表达图式可以用RNA原位杂交、荧光标记抗体等方法方便地显示出来。新近出现的绿荧光蛋白标记技术还可以在活体上追踪靶基因产物的动向。4神经元/gaba基因线虫神经元的结构简单,只有一个或两个不分叉的突起,形成或接受突触连结,但其基本功能与其他动物相似,具有主要的神经递质(乙酰胆碱、五羟色胺、多巴胺、谷氨酰胺等),甚至具有在药理学上相似的受体。神经元细胞核透明可见,突触连接网络图式已清楚,便于用激光微束选择性地杀死细胞。突变分析已发现影响行为的基因约有250个。因此,可以结合遗传分析和细胞损伤来研究线虫的行为。线虫嗅觉反应行为已作过精细的研究,对已测试过的121种挥发性化合物,大约半数有反应。已知影响嗅觉的基因大约20个,其中一些基因的突变能专一地引起特定嗅神经元的形态变异和嗅功能缺损。如odr-1、odr-2、odr-5、daf-11、daf-21基因突变造成对苯甲醛和异戊醇的反应受损,而对其他气味感受无影响。这一现象与用激光微束杀死AWC神经元的结果相同,因而提示这些基因与AWC神经元的功能有关。其他基因突变则引起对相应气味感受的缺损。神经元嗅觉反应的信号分子涉及cAMP,IP3。cAMP依赖通道基因突变,一些嗅觉反应便消失。线虫的排粪过程涉及三组肌肉群在时空上协调的一连串动作。遗传分析表明排粪运动程序是受12个基因控制的,其中任一基因突变可去除其中相应的步骤,但不影响其他动作的进行。如nuc-16突变影响aBoc肌肉群(身体前段肌肉群)动作,而pBoc(身体后段)和Exp(肠收缩)动作不受影响。其他基因突变则影响其他两肌肉群(pBoc和Exp)动作,但不影响aBoc肌肉群动作。这清楚地把排粪程序的遗传控制解析到基因单位了。DVB和AVL是合成GABA的神经元。unc-25突变时GABA合成受阻,并导致Exp动作的缺损。总之,以往线虫研究对神经生物学的贡献突出地表现在两方面:首先,通过遗传分析在活体内鉴定了一些分子在神经元发育和功能中的作用;其次,对线虫结构简单的神经系统结合遗传和形态分析可把从分子、细胞到整体行为研究整合起来。随着线虫基因组全序列测定的完成,这几方面的综合研究必将对神经系统的功能得到更深入的了解。5研究生物.对海因子的基因组织的意义线虫神经系统只有302个细胞(约占体细胞总数1/3),却含有编码脊椎动物脑分子的大多数基因。线虫和哺乳动物之间有关神经递质受体合成和释放途径,G蛋白偶联信号传递途径的基因是高度保守的,而化学感受体和间隙连接基因却是独立起源的。大多数离子通道基因也是和脊椎动物的离子通道基因相似的,但缺少电压激活钠通道基因。线虫基因组编码至少80钾通道,90神经递质门控通道,50肽受体,1000孤儿受体(可能为化学感受体)。许多基因族既含有同源基因,同时也存在趋异的外位基因(outlier),它们可能有未知功能(Tab1)。脊椎动物与学习和突触可塑性相关的蛋白激酶(蛋白激酶A,蛋白激酶G,CAM激酶),在线虫基因组内也有相应的基因存在。cAMP信号传递途径,特别是CREB(cAMPresponseelement-bindingprotein)在长时程记忆中起重要作用,在线虫基因组中也找到1CREB基因。NMDA-谷氨酰胺受体对突触可塑性有重要影响,在线虫基因组中也存在。总之,脊椎动物脑有关学习、记忆的关键分子的基因,在线虫基因组内均存在。此外,对线虫基因组序列的比较分析还发现许多人类神经系统疾病相关基因的同源基因(Tab2)。总之,线虫基因组全序列信息为研究高等动物神经系统提供了一个“平台”。利用基因组全序列信息和计算机辅助同源克隆等新技术将为高等动物分子神经生物学、克隆新基因、分析其功能提供有力的手段。注:在此文编辑过程中,惊悉王亚辉教授于1999年底不幸病逝。现将此文全文刊登,表示我们对他的悼念之情。线虫体形小(成虫长1mm),透明,可在Normaski显微镜下对整个发育过程中每个细胞命运作追踪观察,得出细胞谱系(Fig1,2)。另一方面,利用电镜连续切片和三维重组,对神经系统的解剖结构可作完整的描述。Chalfie(1984)细致地追踪了从胚胎发育各时期到幼虫和成体全部神经元的细胞谱系和细胞核位置。Wood(1988)编著的《线虫(C.elegans)》一书,汇集了神经系统的细胞谱系、全部神经元及其突起的位置,以及神经元连接网络图式等资料。细胞编程死亡(programmedcelldeath,PCD)或凋亡(apoptosis)是指在一定发育时期出现的细胞的自然死亡,在形态和生化上都有别于病理损伤引起的细胞坏死(necrosis)。胚胎学家很久以前就已经观察到在胚胎生长旺盛区域同时存在大量凋亡细胞的现象。然而,细胞编程死亡的生物学意义和遗传控制最早是从线虫研究上突破的。在果蝇发现同源异形基因群(HOM-C)后,用同源异形框(homeobox)探针在从无脊椎动物到脊椎动物都发现有同源异形框基因群。它们决定躯体前后的极性和分节,并控制中央神经系统和中轴器官沿前后轴的区域分化。线虫躯体虽不分节,发现仍然存在一组HX-C基因群,包括7个基因,分散分布在同一条染色体上,它们决定身体前后轴的区域化,并对神经母细胞的决定和迁移起控制作用(Fig4)。线虫虽小,却能感受各种环境刺激(接触、温