失眠动物模型的制作及评价

失眠动物模型的制作及评价

失眠是临床上最常见的睡眠障碍类型，通常指患者对睡眠时间和（或）质量缺乏，并影响日常社会功能的主观体验。失眠表现为入睡困难(入睡时间超过30min)、睡眠维持障碍(整夜觉醒次数≥2次)、早醒、睡眠质量下降和总睡眠时间减少(通常少于6h),同时伴有日间功能障碍。中国睡眠研究会公布的调查结果显示,中国成年人失眠发生率为38.2%,高于发达国家。长期失眠对于正常生活和工作会产生严重负面影响,甚至会导致恶性意外事故的发生。可见失眠不仅是医学问题还是社会问题,失眠症的研究与防治工作已经迫在眉睫。在生物医学研究中,适合的动物模型常用以验证实验及临床假说,进而有效地认识疾病的预防及发生、发展规律,失眠的防治及机理研究也不例外,需要有合适的失眠动物模型作为研究载体。本文从造模的中医、西医指导理论出发,对目前一些常用动物失眠模型的制作及评价进行系统的回顾并展望日后可能发展的方向,以期为失眠症及催眠药物研究提供更多帮助。1临床睡眠模型在失眠的研究过程中,研究者们已选用过大鼠、小鼠、猫、猴等动物构建动物模型。生物的睡眠结构存在差异,有研究表明大脑体积与睡眠周期中各阶段的长度呈正相关。低等哺乳动物如啮齿类动物易繁殖、易饲养,麻醉及手术操作简单,维护费用较低,虽其睡眠时相及睡眠周期均与人类有差异,不能完全模拟临床失眠症状,但啮齿类和人类存在相似的睡眠稳态和神经生化调节机制,因此较适合用于失眠模型的制作。此外,就最常用于造模的大鼠而言,Sprague-Dawley和Wistar是两种常用于各种生理调节实验的杂交鼠,这两种大鼠间Wistar较Sprague-Dawley有显著较大的睡眠总量比值L/D,所以对光照期的睡眠剥夺或睡眠干扰Wistar有可能表现出更多的在黑暗期睡眠总量的增加,此特点可作为实验设计选择失眠模型动物的参考。2失眠动物模型的构建2.1基于中医理论的失眠模型多年来经过学者们的积极探索,现已通过单因素造模法和多因素造模法制作了多类中医证候动物模型。2.1.1中医证候属性大鼠连续3周灌服甲状腺素片混悬液820.5mg·(kg·d)-1,模型组大鼠表现出自发活动、饮水量、进食量显著增加,体质量显著降低,其整体症状与中医心阴虚证中心悸、怔忡、失寐等症相似。此外,有研究对目前公认的失眠模型的中医证候属性进行研究,发现对氯苯丙胺酸(PCPA)失眠模型与中医心肾不交型失眠病证相似。此类造模方法相对简单,但是中医病症并非单一因素所致,因此,不能较好地模拟中医四诊所表达的证候特征,有待进一步改进。2.1.2补充肝郁睡眠大鼠模型单因素造模不能很好地模拟中医研究中所需的证候,随着中医药失眠研究的深入,多因素复合模型应运而生。此类模型多采用已存在的公认失眠模型或造模方法与其他药物或刺激相结合的方式,已达到有效模拟病症结合。有研究采用慢性夹尾刺激和腹腔注射PCPA复合因子造模法建立肝郁失眠大鼠模型,模型鼠表现出与肝郁失眠证相似的宏观体征。黄攀攀等在D-半乳糖制作亚急性衰老模型基础上,采用咖啡因腹腔注叠加多平台水环境持续睡眠剥夺法制作老年阴虚失眠大鼠模型,证候方面表现与阴虚证候有很强的相关性。多因素复合造模能较好的模拟中医证候特点,做到病证结合,但模型在模拟主证的同时也往往会出现多种证候并存的情况,如阴虚模型,同时兼有气虚和血虚的体征,因此,模型对应证候的准确性和一致性有待进一步改进。2.2基于西医的理论指导和失眠模型2.2.1物理方法的建模2.2.1.tsd或选择性睡眠剥夺此类方法在脑电监控下可用于全部睡眠剥夺(totalsleepdeprivation,TSD)或选择性睡眠剥夺(selectivesleepdeprivation,SSD),共同特点是通过动力装置迫使大鼠不停地运动,从而达到睡眠剥夺的目的。较有代表意义的是旋转圆筒睡眠剥夺法与水平转盘睡眠剥夺法。2.2.1.大鼠平台及改良多平台的发展阶段主要利用啮齿鼠畏水的生活习性,装置由水槽及高于水平面1cm的平台组成,啮齿鼠可在平台上站立或进入非快速动眠睡眠(NREM),但当其进入快速动眼睡眠(REM)时,全身肌张力降低引起节律性低头、触水,从而无法进入REM。其发展历经了单平台、多平台及改良多平台三个阶段。关于小平台的面积多有不同报道,据Mendelson等的工作,大鼠体质量(W)与站台面积(A)的比值W/A需≥6.4时,才能得到满意的REM睡眠剥夺,而对照组W/A≤1.73时可允许自由睡眠。目前,实验研究中大鼠平台直径多选用6.5cm,小鼠多选用2.4cm,且直径10cm的平台可用于大鼠REM的不完全剥夺,直径6~7cm的可用于最大REM剥夺。此类方法简单易行,对实验设备要求不高,在不同条件实验条件均能应用,因此广泛应用于REM睡眠剥夺,其中,改良多平台水环境睡眠剥夺法(modifiedmultipleplatformmethod,MMPM)是较为理想的REM剥夺方法。2.2.1.旋转涤纶装置及系统的改良装置是由1个柱形圆筒和小型慢速马达构成,通过圆筒的转动带动大鼠不停运动而达到睡眠剥夺的目的。此方法可在旋转速度和幅度上进行不同调整。Leenaars等对旋转圆筒装置及系统进行改良,在12h睡眠剥夺实验中,装置根据程序设定转动速度和方向随时间推移递增,该改良方法有效的增加了大鼠自主活动,减小了老鼠实验过程的离群感,并使应激反应最小化,使皮质酮浓度保持在生理范围。此类方法睡眠剥夺效果显著,睡眠剥夺可重复性好,且睡眠剥夺长度及强度易于掌控,但长时间受迫运动所引起的应激反应,可能影响睡眠剥夺的效果,其中改良旋转圆筒法可以有效降低应激反应,为较理想的强迫运动法。2.2.1.tsd和ss实验又称disk-over-water-method,由Rechtschaffen在1983最早使用该方法,可进行TSD和SSD实验。该法的优点为可同时对两只大鼠进行REM睡眠剥夺,且可减少因实验条件不同所致的应激反应。2.2.1.sd模型的建立此法共同点为观察到大鼠即将进入睡眠状态时,通过物理刺激使其保持清醒,以建立慢性SSD模型。该法优点为刺激强度相对其他方法较小,且操作简便易行,缺点在于个体对物理刺激感应程度存在差异,且在无脑电图监测条件下,实验过程需实验人员始终观察大鼠行为,易对实验人员产生睡眠剥夺效应,进而引起误差,因而适用于短时间睡眠剥夺实验。2.2.2pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcpa/pcp/基于实验动物的睡眠剥夺根据西医理论使用化学制剂制作的睡眠剥夺动物模型,一种为腹腔或皮下注射药物(多为一些中枢兴奋药)进行部分或全部睡眠剥夺,如腹腔注射PCPA对啮齿鼠进行睡眠剥夺,多用在研究某些催眠药物药理作用机制的实验研究中。此类方法操作简便易行,不需特殊仪器,但鉴于实验动物的个体差异,睡眠剥夺的效果不易掌控;另外一种为直接进行中枢微量给药,有助于催眠药物作用机制的深入研究,此类方法,造模原因确定,但对给药部位及剂量均有较高要求,不易掌握。3模型动物的诊断标准人类疾病的动物模型必须具有人类疾病模拟性表现,但目前没有明确的标准判断以上模型动物是否已经达到诊断标准。从文献结果分析,失眠动物模型制作后是否符合人类疾病模拟性表现,主要有以下检验途径。3.1睡眠情况的描述分析目前,在实验过程中主要利用脑电图(EEG)以及肌电图(EMG)、眼点图(EOG)对睡眠情况进行描述分析。脑电所示相应睡眠时间或者睡眠质量的变化更是检测模型是否制作成功的金指标。3.2确定戊巴比妥钠的阈值此法以睡眠潜伏时间、睡眠时间以及睡眠率等参数来判断模型动物是否失眠,为经典的的失眠模型评价指标。实验前宜进行预实验,以确定戊巴比妥钠的阈上剂量及阈下剂量,通常阈上剂量为30~45mg·kg-1,阈下剂量常选用28mg·kg-1。实验中以动物翻正反射消失达1min为入睡指标,以30s内翻转达3次为睡眠结束指标。3.3确定睡眠动物模型的方法中医疾病证型的判定有两种方法,即正证与反证:正证即辨证求因,反证即以方测证。从病证判定思想的指导出发,评价具备中医证候的失眠动物模型可以通过以下2种方法:①结合不同证形的体征特点,观察动物体征(如活动、饮食、体质量、毛色等)是否符合,以判定造模是否成功;②通过观察不同方剂对该证候模型动物所起的作用或观察相应证型的经典方药对该模型的作用以确定该失眠动物模型的证型归属。中医研究具备病-证-法-方一一对应的特点,结合这一特点,在现代中医证候模型研制工作中,药物反证已经成为衡量模型成功与否的普遍标准。4对临床造成的影响从用于模型制作的动物选择上来说,多数睡眠研究采用正常动物,失眠模型主要为整体施加生理性造模因素所致,存在可逆性,故尚难准确评价药物的睡眠诱导作用及其机理。就模型检测而言,目前,一直将脑电所示相应睡眠时间或者睡眠质量的变化作为检测模型是否制作成功的金指标。但有研究表明,传统的小鼠抓捕方式会造成小鼠焦虑。小鼠麻醉后植入电极,其本身就可能造成小鼠焦虑进而对其睡眠产生影响,电极植入后独立测定脑电,改变了小鼠原来的群居生活环境,也可影响睡眠。因此,无创伤非侵入性EEG与EMG监测等仪器亟待开发。从造模方法而言,单纯的睡眠剥夺模型并未能真正模拟临床中失眠患者不易入睡、醒后不易再入睡的状态,即不能完全反应临床失眠变化的病理过程;各种方法对睡眠的影响与刺激的频率、强度、时间、持续时间及动物个体对于刺激的易感性等多方面因素有关,总体来说,轻度和短期的刺激易导致REM睡眠增加,而长期和大力度的刺激则倾向于扰乱睡眠可以更好的模拟患者的病理状态。因此,在减小模型应激反应的基础上更好的反应临床失眠变化病理过程是未来造模方法发展的一个出发点,此外,还应根据引起睡眠问题的病因建立相应的动物模型。动物模型规范化、标准化是保证中医药现代化研