生物可降解性血管内支架的制备及其生物相容性研究

生物可降解性血管内支架的制备及其生物相容性研究

广泛使用金属血管内支架治疗血管狭窄。支架的结构在材料及其结构上得到了很大改善。然而，随着大量临床实践的发现，在血管内放置金属支架后，25%-30%的患者可能出现血管狭窄。其原因包括金属支架置入血管后可成为永久性金属异物而刺激血管壁,导致血管内膜增生;另外随着时间的推移金属材料逐渐老化,在体液中可被腐蚀并释放出金属离子,对机体产生不良影响。长久以来一直在寻求一种先进的材料制作血管内支架,生物可降解材料的应用曾投入大量的研究,目前国外对生物可降解性血管内支架(biodegradableintravascularstent,BIS)的研究已由基础实验进入到临床应用研究;近年来解放军总医院放射科与清华大学材料科学与工程系合作,采用生物可降解材料聚左旋乳酸(poly-l-lacticacid,PLLA)制备出一种可完全降解的新型血管内支架,并对其物理学、机械力学性能及生物相容性进行了动物实验研究和评估,现予以报道。材料和方法一、bis的制备1.悬浮液的配置将分子量100000U的生物可降解高分子材料PLLA加入到有机溶剂氯仿中,充分搅拌溶解配置成质量体积浓度为10%(g/ml)的悬浮溶液。将悬浮溶液浇铸到特制的不同规格的线形模具中塑型,并置于常温无菌箱中72h以上,使溶液的溶剂挥发和渗透后,再进行真空干燥使聚合物凝固,形成直径为0.1～0.6mm的纤维,即可用为制作支架的基杆。2.基杆浸涂及冷冻首先将氯仿溶解的10%(g/ml)体积浓度的PLLA溶液浇铸成基杆的内部分(占3/5),待液体挥发基杆内部分成形后,再采用浸涂(dip-coating)方法,将基杆内部分在以1,4-二氧六环为溶剂的10%(g/ml)体积浓度PLLA溶液中浸沾,形成基杆的外2/5部分;继而将其放入-23℃的冰箱中冷冻12h,之后取出置于冷冻干燥机中冻干24h;待1,4-二氧六环晶粒升华后,于材料表面即形成多数孔隙(图1)。3.反应蛋白的溶解先将10g明胶蛋白置于100ml水中,加热至60℃,然后置于搅拌器搅拌10min,使明胶蛋白完全溶解。再将支架基杆在明胶溶液中浸沾,取出后又立即置入25%戊二醛溶液中浸沾(戊二醛是交联剂,可使明胶蛋白固化),通过真空干燥后即形成单层涂膜基杆。4.下固结构设计将直径0.1～0.6mm的基杆材料缠绕在宽为2～5mm的折曲板上,置于50℃烘干箱中热固定成形,之后取下缠绕在直径6～15mm的金属圆柱体上,再次热固定成形后取下;按照需要长度裁剪支架、作两端粘接以及相邻支架节段间桥形粘接,最后置于80℃烘干箱中固定成形。制备成螺旋形支架和Z形支架,基杆直径为0.1～0.6mm,支架(扩张后)直径在6～15mm,长度在50～80mm(图2,3)。二、螺旋形和z形支架性能测试选择长度50mm、基杆直径0.5mm、支架展开后直径7mm的螺旋形和Z形支架进行径向支撑力、表面覆盖率、轴向收缩率和支架扩张率等测试,测试方法在此不作详述。三、可分辨率血管内支架的生物多样性实验1.股动脉并压缩固定实验用犬11只由解放军总医院动物实验室提供,犬的雌雄不限,体重为16～25kg(平均21kg),手术前至少观察5d,常规喂养。动物作全身麻醉,采用肌内注射速眠新(长春农牧大学兽医研究所生产)0.1ml/kg体重,根据手术持续的时间和动物的麻醉情况适当追加,总量不超过0.2ml/kg体重。经右侧腹股沟斜形切口逐层分离暴露股动脉,插入5F动脉鞘并经动脉鞘导入5F导管;1次性注射肝素5000IU,术中每小时追加400IU;行腹主动脉及双侧髂动脉造影,确定支架置入的部位、管腔的大小并选择尺寸适宜的支架;支架置入前,将支架压缩于1cm×4cm的球囊上并固定于9F的薄壁导管内。用动脉夹在股动脉的近端断流,切开股动脉将9F带支架的导管逆行插入腹主动脉,借助球囊导管的金属标志将其置于肾动脉开口下方的腹主动脉内;之后导管回退使球囊支架暴露,将在微波炉内加热至沸腾的对比剂用压力注射器以6～8atm(1atm=101.325kPa)的压力注入扩张球囊,持续10～20s,反复3次;同时经球囊端孔注入常温对比剂,以比较近端腹主动脉的直径和球囊的直径,避免球囊过度扩张损伤腹主动脉管壁(图4);最后抽空球囊内对比剂使球囊回缩,退出球囊导管。采取同样步骤将第2枚支架置入同侧髂动脉(图5)。支架放置完毕后,对股动脉切口行连续缝合。术后14d内,给予阿司匹林100mg/d喂服。支架释放后,应立即造影观察血管直径、管腔通畅情况和血管壁有无损伤;动物处死前,再行血管造影观察支架置入段血管改变。2.病理组织学检测支架置入后,分别于术后即刻及术后1、2、4、8、12周对实验犬实施过度麻醉和静脉气栓法处死,取出腹主动脉近端至双侧髂动脉远端的血管作为标本并以10%甲醛溶液固定(图6),继而将支架置入段及其邻近1cm内的血管取下行石蜡包埋、切片(3μm厚),行HE染色和Verhoeff-VanGieson染色,供光学显微镜(简称光镜)观察及组织病理形态学分析。电子显微镜(简称电镜)观察:(1)取下支架段1.0cm×0.5cm血管壁,用0.1M的磷酸缓冲液(pH=7.2)进行清洗;(2)以2.5%戊二醛磷酸缓冲液固定2～3h后;用0.1M的磷酸缓冲液清洗4次,每次15min;(3)以1%锇酸缓冲液固定2h,再用0.1M的磷酸缓冲液清洗4次,每次15min;(4)以乙醇作和乙腈作梯度脱水;(5)临界点干燥,离子溅射仪镀膜;(6)应用HITACHIS-450型扫描电镜20kV加速电压扫描,观察血管内皮细胞生长情况及血管结构。应用图像分析系统(型号:TIPAS/88解放军计算机研究中心设计),对支架置入后不同时期血管内膜生长厚度进行测量,确定其内膜面积(μm2)。结果一、轴向收缩率比较螺旋形PLLA支架的径向支撑力为2kPa(1kPa=7.5mmHg)略大于Z形PLLA支架(1.6kPa)。螺旋形支架的轴向收缩率<10.0%,而Z形支架的轴向收缩率<8.0%,较螺旋形支架的轴向收缩率略小。螺旋形支架的表面覆盖率为18.0%,大于Z形支架(16.0%),螺旋形支架的扩张率(指压缩后支架直径与释放后完全展开支架直径的比值)为6.5,与Z形支架相似(6.0),螺旋形和Z形2种支架的测试结果见表1。二、支撑释放后动物的皮肤变化11只实验犬血管内成功置入22枚支架,X线下支架本身不显影,皆借助释放球囊定位标志成功地将BIS置入到预定血管。手术过程顺利,全部动物存活;2例动物腹股沟切口处出现皮肤感染,经局部创口处理和肌内注射抗生素后愈合。支架释放后造影显示,血管腔通畅,无管腔内充盈缺损和血管壁损伤性改变。动物处死后标本显示全部支架展开良好(图7),1枚腹主动脉内支架向下移位,其余位置良好。1.炎性细胞诱导形成反血茶苷支架置入后1周,支架杆部可见少许纤维组织和少量血小板沉着;置入后2周,于支架杆部周围见少量新生内膜形成,偶见炎性细胞浸润,多为淋巴细胞和巨噬细胞,未见中性粒细胞;置入后4周,支架杆部大部分被新生内膜覆盖(图8);8周时支架被内膜完全覆盖,未见明显的内膜增生,管壁光整、管腔开通,炎性细胞消退(图9);12周后获取的血管标本经手压迫触摸,感觉支架段血管弹性显著,仍有较强的支撑力。2.电镜观察结果置入4周后,均匀覆盖于支架表面的内皮细胞发育成熟、排列规则紧密,形态与邻近血管内膜相似。3.图像分析的结果系统测量BIS置入后不同时间点的血管内膜生长情况,详见表2和图10。bis的生物材料BIS是近年来备受到关注的新型血管内支架,因其具有许多金属支架不可比拟的优点,国外学者对其进行了大量研究。制备支架的生物可降解材料必须具备良好的生物相容性、足够的力学性能、可加工性、可消毒性及生物可降解性(即在生理或体内环境下组成材料的高分子链能自动断裂形成小分子而逐渐被机体代谢或吸收)。用于制作BIS的材料有多种,如:胶原蛋白(collagen)、聚乳酸(polylacticacid,PLA)、聚左旋乳酸(poly-l-lacticacid,PLLA)、聚原酸酯(polyorthoester,POE)、聚乙内酯(polycaprolactone,PCL)、聚乙二醇酸(polyglycolicacid)等,但以PLLA应用较多。PLLA是一种可完全降解的生物材料,近年来许多学者对其合成、形态学、热性能、机械性能及其在体内和体外的降解动力学进行了研究;因其具有成本低、综合力学性能好、炎症反应小等优点,已被美国食品与药物管理局(FDA)批准为置入人体的生物工程材料。一、双组分纤维及其性能聚左旋乳酸是由L型丙交酯或乳酸的聚合制得,其纤维的物理和机械性能介于聚酯和聚酰胺之间,其熔点大约为80℃、密度1.27g/cm3、吸湿率0.6%、折光指数1.45、结晶度约为83.5%。PLLA纤维具有较好的抗张力强度、柔顺性、热稳定性和机械性能。此外,PLLA具有较高的结晶度、纤维结构规整,还具有良好的生物相容性和生物降解性,在体内可逐渐降解为二氧化碳和水,对人体无毒性或无积累毒性。二、古支架的基础构造作为新型的支架材料,PLLA具备一定的载荷性能,可携带药物或基因,随支架置入至病变血管壁直接高浓度释放,使药物的供给率或基因的转染率明显提高。PLLA的吸湿率虽可达到自重的0.6%,但对于成型支架所需的载荷量来说还远远不够,为此需要对支架的基杆进行造孔。造孔必须在基杆的表面进行,以免影响支架的力学性能。笔者采用1,4-二氧六环为溶剂和造孔剂,材料固化后,使1,4-二氧六环升华即可形成多数三维立体孔隙。此种造孔方法较为理想,因为溶解PLLA的溶剂和造孔剂为同一物质,省去了此后烦琐的加工步骤。其原理是利用溶剂的结晶产生的固液相分离,具体步骤为:在冷冻干燥过程中,当溶液温度低于溶剂的凝固点时溶剂开始结晶,一旦结晶产生即可引起固液相的分离,进而当溶剂形成的晶体升华后,就形成了有孔洞的泡沫;而且由于固化时的温度梯度(从表面到中心)所致,可产生多数高度各向异性的孔洞结构(支架有各种各样的孔状结构)。现今人们已掌握控制支架孔状结构的技术,能制备孔径从几微米到几百微米、孔隙度不同的海绵状多孔结构的支架基杆,供载荷不同成分的需要。三、涂膜支架的制作控制支架载荷物质的释放,与支架基杆造孔一样是BIS制备的一个重要课题。未经特殊处理的支架基杆,其空隙内载荷物质的释放是通过载荷物质弥散实现的,而掺入于支架材料中的物质是在支架降解过程中完成的。要达到控制载荷物质的释放速率,需要对支架空隙进行特殊处理。如采用不同降解速率的材料对支架空隙进行涂膜封闭,即可达到支架缓释的目的;涂膜材料内也可掺入药物,在其降解的同时将药物释放。笔者设计制作的涂膜支架还可用于如下研究:支架基杆表层可以涂布防止血栓形成的PLLA薄膜,此膜降解的时间需要1周左右,可使支架裸露于血管腔期中有效地防治血栓形成;此膜降解后,支架基杆的空隙开放,释放出抗增生类药物将防治血管平滑肌增生。虽然通过对支架基杆的造孔和分层涂膜,达到了支架载荷物质的缓释效果,但是控制载荷物质的精确释放速率是一项精细的工程,涉及到涂膜材料的降解时间、支架基杆空隙的大小和排列,以及所释放药物的化学特性等因素,尚需深入研究。四、臂架的物理和机械特征衡量血管内支架性能的参数很多,除了对支架材料的评价之外,对支架整体性能的测试,也是衡量支架性能的重要指标。1.支架安装的影响是支架对径向外压的抗力或支架对作用外力的应变力,此特性决定展开的支架能否牢固贴附于血管壁。支撑力弱的支架释放后,支架不能紧贴血管壁并给予狭窄段血管足够的力学支撑,从而易发生移位;支撑力过强的支架释放后,可造成局部血管壁的损伤并嵌入到血管壁内引起周围组织过度的修复反应,导致内膜过度增生或局部血管的动脉瘤。2.金属支架直径、支架网眼大小支架表面积(stentsurfacearea,SSA)和其展开面积(opensurfacearea,OSA)的理想比值不应大于0.2。因为金属或合金表面都有促凝作用,因此金属表面积越小,血栓形成的几率越小,同样大小的1只支架,展开充分者比展开不完全者血栓形成的几率低。金属支架直径、支架网眼大小直接与此几率有关。本研究制备的Z形BIS表面覆盖率为0.16,且PLLA的血栓原性较金属支架低,符合支架的要求。3.支架抗压抗差为压缩后支架直径与释放后完全展开支架直径的比值,也即支架扩张率。理想的支架扩张率应大于6,小于4的支架不宜使用。如1只直径压缩为1.25mm的支架,释放展开后直径应在7.5mm以上,如在5mm以下是不能使用的,本研究制备的螺旋形BIS扩张率为6.5、Z形BIS为6.0,较金属支架的扩张率略差,但可以满足支架释放的要求。4.支架设置的短缩支架释放后,随管径扩大的同时可出现非线性缩短。若术前估计不足,置入的支架过分短缩,可导致支架不能完全覆盖病变,甚至损伤血管;因此,术前必须选择长度和管径相宜的支架,本研究制备的螺旋形BIS纵向缩短率小于10%、Z形BIS小于8%,低于一些金属或合金支架。5.bis为催化剂的支架布置由于生物可降解材料PLLA的密度低于金属材料,BIS不能像金属支架那样于X射线下清晰显影;因此,BIS释放时必须借助释放器的金属定位标志做参照,但此法不适用于日后的复查。为此国外学者曾尝试于BIS的两端镀金以增加支架的显示率,但效果不良;目前采用的血管造影或血管内超声等检查方法,有利于BIS置入血管后的复查。本研究采用100000U高分子量PLLA制成的Z形血管内支架具有良好的柔顺性和弹性,易于在血管内释放;置入11只犬血管内的22枚BIS其展开和开通性均较好,机械支撑力可满足实验要求,仅见1枚支架移位,(可能为所选择支架的直径与置入血管的管径不匹配所致)。本实验研制的BIS还具有热塑特性。当其置入靶血管后,用压力注射器以6～8atm的压力扩张球囊之际,将加热的对比剂注入。除了扩张支架外,还将温度作用于支架使其热塑型,以促进支架恢复其原构型,并产生足够的支撑力。五、bis的应用Stack等于1988年设计和制作了第1枚生物可降解性血管内支架,体外实验可承受133kPa的压力达1个月之久,支架于9个月内几乎完全降解。此后,许多学者曾应用不同的生物可降解材料设计制作各种类型支架,对其生物相容性进行了研究并取得良好的效果。聚乳酸是目前用于制作BIS的最常用材料,聚乳酸及其共聚物也早已在医疗界得到广泛的应用,主要用于外科缝线、药物缓释胶囊、骨骼固定修复材料及骨细胞支架等方面。早期制作的BIS置入动物血管后,可导致暂时性的异物反应;之后Lincoff等发现:低分子量PLLA置入动物血管后可引起局部血管少量血栓、内膜增生及局限的反应性炎症,而高分子量PLLA则无明显的病理性反应。近期Tamai等设计和制作了1种新型热球囊扩张式BIS,并首次将其置入人体冠状动脉内:19处冠状动脉狭窄性病变处置入25枚BIS,置入后1d、3个月及6个月血管造影和血管内超声评价表明,BIS于人体冠状动脉内未引起明显的内膜增生性反应。本研究采用自制的Z形BIS置入血管后,其病理学观察证实此种支架具有良好的生物相容性:置入血管后新生内膜渐次覆盖支架表面,8周时支架被新生内膜完全覆盖,8周后血管内膜增生减少,偶尔可见炎性细胞浸润,无显著炎性反应。六、生物可降解性血管再狭窄BIS的降解过程受其制作材料特性的影响,聚乳酸及其共聚物降解的早期阶段是