医学免疫学教学课件：22-免疫学检测技术的基本原理

免疫学检测技术的基本原理

本章要求掌握：凝集、沉淀反应与免疫标记技术的原理。熟悉：凝集、沉淀反应的应用。免疫标记技术的应用。免疫学检测方法免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法。第一节体外抗原抗体结合反应的特点及影响因素(一)抗原抗体反应的特点抗原抗体结合的特异性抗原抗体结合的可逆性适宜的抗原抗体浓度和比例抗原抗体反应的两个阶段抗原抗体结合的特异性抗原抗体结合的特异性由抗原表位与抗体分子中的超变区互补结合所决定。互补程度越高，特异性越强，亲和力越高。亲和力指抗体分子单一抗原结合部位与一个相应抗原表位之间互补结合的强度。用已知抗原检测未知抗体，也可用已知抗体检测未知抗原。抗原抗体结合的可逆性非共价键结合，易解离范德华力静电引力氢键疏水键解离后抗原和抗体仍具有原来的特性解离度取决于抗体亲和力的大小环境因素：如温度、酸碱度等适宜的抗原抗体浓度和比例Ag与Ab的浓度和比例适当Ag-Ab复合物体积大、数量多肉眼可见Ag过剩Ab过剩Ag-Ab复合物体积小、数量少肉眼不可见抗原抗体反应的两个阶段

①特异性结合阶段反应迅速一般不出现肉眼可见的反应②可见反应阶段小的Ag-Ab复合物形成较大复合物的过程易受温度、电解质和酸碱度等影响（二）抗原抗体反应的影响因素电解质温度：37℃pH：6-8之间

根据抗原物理性状的差异或参加反应的其他辅助成分的不同，可出现不同类型的反应：凝集反应沉淀反应免疫标记技术第二节检测抗原和抗体的体外试验1.凝集反应(Agglutination)颗粒性抗原＋相应抗体凝集可溶性抗原＋相应抗体不凝集可溶性抗原—颗粒载体＋相应抗体凝集常用载体

RBC

聚苯乙烯乳胶活性碳胶体金细菌、细胞等颗粒性抗原或可溶性抗原吸附于颗粒载体上，与相应的抗体在电解质存在的条件下结合，出现肉眼可见的凝集团现象，称为凝集反应。直接凝集反应间接凝集反应凝集反应可用于菌种鉴定和人类ABO血型鉴定诊断伤寒或副伤寒的肥达氏实验等。2.沉淀反应precipitation可溶性抗原＋相应抗体沉淀物方法：1、单向琼脂扩散2、火箭电泳＝单向琼脂扩散＋电泳3、双向琼脂扩散4、对流免疫电泳＝双向琼脂扩散＋电泳5、散射比浊（敏感、精确、自动化）6、速率散射比浊双向琼脂扩散3.免疫标记技术(immunolabellingtechniques)用酶、荧光素、同位素等物质标记抗体或抗原进行抗原抗体反应，检测抗原或抗体的技术。1.常用标记物质：酶：HRP、AP

荧光素：FITC、RB200

放射性同位素胶体金2.优点：提高了抗原抗体反应的敏感性。可用于抗原定位（组织切片、细胞涂片、活体定位），在细胞或亚细胞水平上观察鉴定抗原、抗体等。(1)免疫酶测定法用酶标记抗体或抗抗体进行的抗原抗体反应，以底物被酶分解后的显色深浅来反应待检样品中抗原或抗体的含量。1.常用酶：辣根过氧化物酶（Horseradishperoxidase,HRP）碱性磷酸酶（Alkalinephosphatase,AP）2.常用方法：免疫组织化学技术酶联免疫吸附试验(ELISA):目前应用最广泛。酶联免疫吸附试验（ELISA）用酶标记抗原或抗体，在固相反应板上进行抗原抗体反应的方法。常用于检测体液中的微量抗原和抗体，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、容易判断等优点。为了检测抗体可用间接法。为了检测抗原可用双抗体夹心法。

如测血清中的抗HIV抗体如测血清中的乙肝表面抗原2）酶免疫组织化学技术应用酶标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定位、定性、定量的检测。抗原抗体反应的特异性和组织化学的可见性。在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质。ＨＲＰ底物分解成难溶性沉淀物（棕褐色）（二氨基苯胺，ＤＡＢ）优点：可用普通光学显微镜观察；酶标抗体染色后，标本还可用其他染料复染，以显示细胞形态或细胞核；标本可以长期保存；酶作用底物的分解产物为电子致密物质，也适合于作电镜观察；（2）免疫荧光技术荧光素：1、异硫氢酸荧光素（黄绿色荧光），FITC,495nm2、罗丹明（红色荧光）,RB200,3、藻红蛋白，PE荧光显微镜（3）放射免疫测定法

Radioimmunoassay,RIA同位素分析的灵敏性＋抗原抗体反应的特异性优点：灵敏度高特异性强精确性好样品用量少测定方法规范、自动化常用同位素：125I、131I、

3H等第三节免疫细胞功能检测一、免疫细胞的分离选择性分离细胞的依据：细胞大小、密度、表面电荷、粘附能力、细胞吞噬能力、细胞膜上的特异性标志等；（一）外周血中单个核细胞分离单个核细胞＝淋巴细胞＋单核细胞是进行T、B细胞分离纯化的过程的第一步细胞分离液：葡聚糖-泛影葡胺（Ficoll-Urografin）密度梯度离心法根据外周血中各种血细胞比重不同使不同密度的细胞呈梯度分布人的红细胞密度为1.093粒细胞密度为1.092单个核细胞约1.075分离液密度为1.077±0.001（二）淋巴细胞及其亚群的分离1、磁珠分离法先将特异性抗体（如抗CD4）吸附磁性微珠上2.荧光激活细胞分离仪分离法又称为流式细胞术（Flowcytometry,FCM）将光学流体力学、电子学和计算机等多种技术综合为一体，对单个细胞进行快速、灵敏、多参数的定量测定，并进行综合分析的一项技术。需要流式细胞仪（二）淋巴细胞及其亚群的分离流式细胞仪主要原理

将细胞悬液与标有荧光素的单克隆抗体反应。细胞经喷嘴流出，每一微滴只含一个细胞。微滴经过检测器时，检测器根据激光束的散射，判断每滴是否含有细胞。借助光电效应，微滴通过电场时，可出现不同偏向。利用不同的荧光素标记的单克隆抗体染色，能同时分析细胞表面的2～3种表面标志，因此可以收集所需类型的细胞，并以数字显示细胞数量。（二）淋巴细胞及其亚群的分离3.抗原肽-MHC分子四聚体技术二、免疫细胞的功能测定1.T细胞功能测定2.B细胞功能测定3.细胞毒试验4.吞噬功能测定5.细胞因子的检测1.T细胞功能测定

迟发型超敏反应的检测：皮试T细胞增殖试验形态学方法：淋巴母细胞计数

3H—胸腺嘧啶核苷掺入法

MTT检测法：

线粒体脱氢酶

四甲基偶氮唑蓝紫褐色甲潜颗粒（被异丙醇溶解）

570nm测吸光值2.B细胞功能测定

Ig的检测（单向琼扩、ELISA等）抗体形成细胞检测溶血空斑试验酶联免疫斑点试验（ELISPOT）溶血空斑试验3.细胞毒性试验检测CTL、NK等细胞杀伤靶细胞活性检测方法同位素释放法Na51CrO4

乳酸脱氢酶释放法4.吞噬功能检测硝基蓝四氮唑试验

NBT为水溶性淡黄色染料，被吞噬进细胞内；细胞在杀菌过程中产生超氧阴离子，使NBT还原为蓝黑色甲潜颗粒，沉积于胞浆内；计数NBT阳性细胞，反映中性粒细胞的杀伤功能。巨噬细胞吞噬试验5.