植物微生物生态学研究现状与展望

植物微生物生态学研究现状与展望

近年来，随着人们越来越重视生态环境，微生物生态学的发展呈现出高度加快。20世纪90年代，生物遗传因素的引入进一步深化了该领域的研究。传统的分离方法所能鉴定的微生物只占环境微生物总数的0.1%-10%,已远不能满足微生物生态学研究的需要。因此,应用现代生物化学和分子生物学技术方法,克服传统微生物生态学研究技术的局限性,获取更加丰富的微生物多样性信息,从而为推动当今微生物生态学研究的进一步发展具有重要的意义。植物微生物生态学是研究植物微生态系统的一门学科,研究植物组织细胞内微生物的组成、功能、演替,以及微生物之间和微生物与宿主之间的相互作用关系的生命科学分支。植物中微生物种类也较为丰富,已有诸多研究表明植物的根、茎、叶、穗中存在大量与植物有某种相互关系的微生物,在植物微生态系统中有着至关重要的作用。目前,应用于植物微生物生态学的现代生物化学技术主要有脂质分析技术、BIOLOG技术及蛋白质组学研究技术等;现代分子生物学技术主要包括限制性片断长度多态性(RFLP)、扩增rDNA限制性分析(ARDRA)、16SrDNA克隆文库构建与系统发育分析技术、变性梯度凝胶电泳(DGGE)及荧光原位杂交(FISH)技术等。这些现代技术方法对于与植物联合的微生物的多样性及其在生态系统中作用的研究越来越受到重视。1现代生物化学技术在植物微生物生态学研究中的应用1.1微生物群落分析磷脂脂肪酸(PLFA)是活体微生物细胞膜恒定组分,不同种属之间微生物差异明显,且对于环境因素较为敏感,利用特征PLFA数量和不同脂肪酸之间的比值可以反映微生物群落的结构和相对数量,并可通过跟踪观察PLFA的组成和量的变化,揭示植物微生物生态环境中微生物群落结构组成和变化规律。目前PLFA分析方法已广泛运用于环境微生物研究领域。BIOLOG微生物分析系统具有灵敏度高、分辨力强、无需分离纯种微生物、操作简便等优点,可以对微生物群落进行生理图谱(CLPPs)分析,从而在生理代谢水平上对微生物群落进行检测。吴振斌等通过磷脂脂肪酸(PLFA)分析,研究了复合垂直流人工湿地基质剖面的微生物群落结构及其分布特征,结果表明,特征脂肪酸的比例呈垂直分布,基质中好氧原核微生物为优势种群,其次为革兰氏阳性细菌及其它厌氧细菌,真核微生物所占比例最低,PLFAs的组成差异可反映人工湿地中不同位点基质微生物群落结构的差异。李祖明等采用磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法评价了碱性果胶酶对油菜叶际微生物群落的影响,通过磷脂脂肪酸主要成分分析表明,喷有酶活力为10μ/mL的碱性果胶酶的样品与其他处理及对照样品的微生物群落结构差异明显。谷立坤等利用磷脂脂肪酸(PLFA)分析方法和利用BIOLOG技术,比较了北京通州、顺义、昌平、延庆地区玉米叶际微生物的多样性,并调查了通州地区玉米叶际微生物群落在不同生长季节的变化情况。PLFA分析结果发现所有的监测样品中,革兰氏阳性细菌生物量均高于革兰氏阴性细菌生物量,聚类分析结果表明玉米叶际微生物群落结构受到时空因素的影响,不同地点、不同生长季节玉米叶际微生物群落结构有较大差异。BIOLOG分析结果表明6、7月玉米叶际微生物碳源利用活性较8、9月份高,不同生长地点、生长时间的玉米叶际微生物碳源代谢差别明显,这项研究为玉米的种植生产以及病虫害防治提供了必要的微生物学理论知识。1.2浮液对水稻细胞中蛋白组织化学的影响除环境因素外,植物的生长发育还与微生物的活动密切相关。但植物受到微生物共生、寄生和病菌侵害时,将改变体内蛋白的表达来完成信号的感应、传递,引起植物相应的反应机制。因此,利用蛋白质组学技术方法研究相关蛋白将有利于更好地了解植物与微生物之间的相互作用机制。Kim等用水稻病原菌对水稻悬浮培养细胞进行处理,对诱导产生的病原相关蛋白OsPR10,异黄酮还原酶类似蛋白OsPR10和β-葡聚糖酶等蛋白等进行了首次报道。Chen等利用双向电泳技术,分析水稻抗虫材料、感虫材料受虫害与未受虫害的秧苗蛋白质的变化,找到一个分子量为40kD、等电点为6.3的差显蛋白质P40,推测P40与水稻受褐飞虱虫害后引起的应答反应相关。为了解水稻黄斑驳病毒(RYMV)对水稻产量的影响,Ventelon-Debout等对两个水稻品种IR64(对该病毒敏感)和Azucena(相对不敏感)的悬浮培养细胞蛋白质组的研究表明,病毒感染后两者分别有40和24个蛋白点表达有明显变化,有些只在IR64中表达,如HSP70、PR-10a、乙烯诱导蛋白等,有些只在后者中存在,如ChaperoninCPN60-2等,而与糖酵解有关的酶在两个品种中都有变化。Campo等在研究玉米萌发种胚对真菌侵染后的防御反应时发现,有9个蛋白在真菌侵染后上调表达,它们主要参与植物组织抗氧化合解毒、蛋白质的合成和折叠。特别是翻译起始因子eIF-5A表达量提高,暗示它可能与植物防御反应直接有关。此外,还有报道通过2-DE分离分析水稻在稻瘟病侵染条件下叶片蛋白的表达变化及小麦在条锈菌、镰刀菌侵染时其根组织及叶片蛋白质组的表达变化。在豆科植物和固氮根瘤菌间的共生结合形成的根瘤中,类菌体周隙(peribacteroidspace,PS)是类菌体周膜(peribacteroidmembrane,PBM)与细菌质膜之间的间隙,是共生体成员之间交换代谢产物的媒介。Saalbach等用蛋白质组学分析方法,鉴定了PBM与PS中的蛋白,结果表明PS甚至PBM的制备物中含有大量的类菌体蛋白。Panter等从大豆根瘤中分离出环行细菌的PBM蛋白,并对其进行N端测序。共获得了17个PBM蛋白的蛋白质数据,其中6个蛋白质是已知功能的同源蛋白质,并首次证明HSP60和HSP70两种同源蛋白在共生体中作为细胞质蛋白质翻译时和翻译后转运的分子物质基础。此外,Sarma等研究大豆和土壤细菌间的共生固氮过程,2-DE分离类菌体蛋白证明类菌体在氮、碳代谢中表达了一个主要的、精细的蛋白网络,但缺乏脂肪酸和核酸代谢,几个蛋白参与了细胞解毒、胁迫调节和信号传达。这些研究对于深入了解农作物与根瘤固氮菌的互利共生关系及其相关分子机制具有重要的意义。目前,本课题组在多年研究与植物相联合的细菌的工作基础上,着手以与水稻根面相联合的细菌生物膜外膜蛋白为研究切入点,以从水稻品种“越光”根面分离得到的一株植物促生细菌肺炎克雷伯氏菌NG14为材料,利用蛋白质组学技术研究其生物膜形成前后外膜蛋白变化情况,发现若干种蛋白表达量发生变化,其中外膜蛋白OmpC的前体蛋白在NG14形成生物膜后明显上调表达(数据尚未发表),为研究与植物联合的细菌生物膜形成相关因子提供了依据,进而对深入了解植物与微生物相互作用关系及进一步改善植物微生物生态系统具有重要的参考价值。2现代生物技术在植物微生物生态学研究中的应用2.1pcr-rflp扩增检测限制性片段长度多态性(restrictionfragmentlengthpolymorphism,RFLP)是一种DNA分子水平上的多态性检测技术,它是限制性内切酶、核酸电泳、印迹技术、探针-杂交技术的综合应用。该技术也已广泛用于微生物群落的研究。PCR-RFLP可以检测出碱基发生突变、插入、缺失的位点。限制性内切酶能识别并切割特异核苷酸序列。由于不同来源的DNA具有不同的限制性内切酶酶切位点的分布,每一种DNA限制性酶组合所产生的片段是特异的,从而产生多态性,所以它能作为某一DNA的特有指纹。切割产生的不同片段通过特定探针杂交进行检测,从而可比较出不同品种的DNA水平的差异(即多态性)。多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系,该方法检测结果不受环境因素的影响。但是该技术所用限制酶的选择通常凭经验,正常情况下必须使用多种酶。因为一种酶可能在两种DNA片段的同一位置进行切割。为了克服RFLP技术上的缺陷,将PCR技术和荧光标记技术与之结合,发展出了ARDRA技术及T-RFLP技术。2.2基于arra的16srdna分析扩增rDNA限制性分析(amplifiedribosomalDNArestrictionanalysis,ARDRA)是16SrDNA-PCR技术与RFLP技术相结合而发展起来的分子微生物生态学研究技术,该方法不受菌株是否纯培养的限制,不受宿主的干扰,具有特异性强,效率高的特点,因此广泛适用于研究各种环境中的微生物多样性和系统发育关系。ARDRA技术原理是利用PCR选择性扩增DNA片段,在对PCR产物进行限制性酶切片段多态性分析(RFLP)。当用限制性内切酶对16SrDNA片段酶切时,会产生多态性的片段,可用于对微生物进行鉴定及多样性分析。ARDRA技术目前主要是应用于细菌的鉴定及克隆文库的分析,群落中的每一种微生物的rDNA序列不同,其rDNA指纹图谱也就各不相同,因此可用于混合微生物群落的研究。本研究组近年来在对高产杂交水稻金优611种子固有细菌群落多样性探究过程中,利用ARDRA技术对培养方法所分离得到的91株细菌进行分型,确立不同的分类操作单元(operationaltaxonomyunit,OTU)后进行16SrDNA系统发育分析,结果显示上述91株细菌分属为10个属16个种。ARDRA技术的缺点是工作量大,目前应用该方法进行微生物群落结构分析,尚未设置重复性试验。2.31测序与序列比对构建16SrRNA基因克隆文库是微生物生态学中常用的研究方法之一。构建16SrRNA基因文库主要是将环境样品的基因组总DNA进行16SrDNA-PCR扩增,得到样品中不同微生物的16SrDNA的混合物,通过构建克隆文库分离不同的序列,再通过测序与GenBank数据库中已知菌种的16SrDNA序列进行比对,从而该菌株的分类地位,通过分析rDNA片段的类型和出现频率,可反映环境微生物群落结构和多样性的信息。所构建的文库只要库容足够大,就能充分反映环境中微生物的种类和数量,使得对所研究的样品中微生物群落结构有一个全面客观的认识。该方法的缺点是工作量大,且不利于对样品进行动态变化的观察。本课题组在多年来利用16SrRNA基因克隆文库研究植物微生物生态学的基础上,报道了基于16SrDNA的系统发育分析在微生物进化关系中的应用策略,对系统发育树的构建进行了详细地介绍,并对其在微生物进化研究中的具体应用进行了阐述。2.4dage检测植物微生物群落多样性及群落动态变化在现代分子生物学技术中,变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)技术已经发展成为研究环境微生物群落组成及其亲缘关系的主要分子工具,广泛用于比较微生物多样性和种群的动态监视。目前PCR-DGGE技术已深入到各个研究领域,广泛应用于研究湖泊、海洋、活性污泥、发酵食品及各种土壤等生态环境中的微生态研究中,近年来随着植物相关细菌研究的深入进行,微生物生态学的研究领域又深入到植物微生物生态学领域。DGGE技术在植物微生物群落多样性及群落动态变化的国内外研究进展以及引起DGGE偏差的因素及其解决方法本课题组已作过报道。此外,本课题组利用PCR-DGGE技术研究两种基因型水稻种子萌发过程12-96h不同时间框架内种子际(spermosphere)细菌群落动态变化情况。通过对DGGE图谱中主要条带的序列分析结果显示,水稻种子际细菌群落中均有两类细菌存在,种子萌发过程中来源于种子内生细菌的种子际细菌群落结构受种子基因型、萌发时间等因素的影响。与母本相比,杂交子代种子萌发过程中,种子萌发出芽时间较短,种子分泌物较母本混浊,种子际细菌群落结构更为复杂,细菌群落多样性更为丰富(数据尚未发表)。2.5生物生态学上述分子生物学技术虽然能够快速、精确地揭示植物微生物生态系统中微生物的种类和多样性,然而这些方法无法提供微生物形态学、空间分布和生物体细胞环境等信息,并且PCR对环境样品分析存在一定的偏差。荧光原位杂交(fluorescenceinsituhybridization,FISH)技术是一种分子细胞遗传学分析技术,问世于20世纪70年代后期。它可用于鉴定和定量分析特异微生物、测定不可培养微生物的形态特征及丰度、诊断微生物群落空间结构与群落动态;结合其他手段还可用于研究复杂环境中的原位基因表达,如启动子诱导及其表达的时序金进程、生物膜上微生物的空间分布、混合菌群中特定生物的代谢活性。FISH技术可以再现微环境中完整细胞的景象信息,具有更好的精确性,不需要额外的抽提和扩增等,被广泛应用于植物微生物多样性的研究工作中。Watt等用FISH技术分析了小麦根系的固有细菌及丝状菌的量及分布状况。空间分析表明细菌在根部表面周围11μm之内处于稳定状态,40%在根部丛生。定量分析表明在小麦根系细菌平均细胞量为15.4×105cell/mm3,丝状菌的量占总菌数的4%。近几年来,FISH技术逐渐向生态学领域尤其是微生物生态学领域渗透,利用此技术已经在微生物生态学研究中取得了一系列重大成果。但是,FISH技术也有其不足之处,样品自身产生的荧光,以及探针的特异性都会影响试验的结果。随着技术的不断进步,FISH的准确性和灵敏度将进一步提高,必将在植物微生物生态学研究领域得到更加充分的应用。3生物化学与生物学的研究现代生物化学与分子生物学技术在植物微生物生态学研究中克服了微生物培养技术的限制,可以对样品进行较客观的分析,较精确地揭示微生物的种类和遗传多样性。随着生物化学与分子生物学技术的发展,其中的一些技术方法已被广泛应用到了植物微生物生态学的研究当中,从而能够