基因表达分析技术

医学分子遗传学第四章分子遗传技术方法

基因表达分析技术METHODSFORANALYZINGGENEEXPRESSIONSpeaker：2023/10/21genemRNAProteinpolypeptidechainGeneExpression2023/10/22一、实时荧光定量PCR

（realtimequantitativePCR，RT-qPCR）2023/10/23实时荧光定量PCR

(realtimequantitativePCR，RT-qPCR)是荧光化学物质与PCR产物相结合，在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实现了实时监测整个PCR进程，对起始模板进行定量分析的方法。荧光定量实时PCR与普通PCR的比较

在线实时监控对样品扩增的整个过程进行实时监控，能够实时地观察到产物的增加，直观地看到反应的对数期

降低反应的非特异性使用引物和荧光探针同时与模板特异性结合，提高了PCR反应的特异性

增加定量的精确性全程监控，精确定量

结果分析更快捷方便，无需电泳

荧光染料

SYBRGreenI是一种结合于双链DNA（double-strand,dsDNA）

小沟中的荧光染料，游离的荧光染料不发出信号，所以开始时检测不到荧光信号，随着扩增的进行，染料不断地与dsDNA结合而发出荧光，被荧光探测系统检测到。2023/10/26非特异性荧光染料标记：SYBRGreenI特异性荧光标记：TaqMan优点与特异性的荧光探针相比价格便宜

只需要设计PCR引物荧光信号强与其它探针相比设计简单可用于多通道检测可用于SNP的检测缺点由于它和模板的结合是非特异性的，它可以和所有的双链DNA包括引物和非特异性扩增产物结合，不能真实反映目的基因的扩增情况比DNA结合染料价格高2023/10/27Ct（thresholdvalue）值是指荧光信号达到设定阈值时所经历的循环数，此时荧光信号明显高于背景荧光信号。2023/10/28Ct值与模板起始浓度的关系

模板起始浓度越高，Ct值越小

Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系

如果模板浓度增加1倍，Ct值就提前1个循环到达如果模板浓度减少1倍，Ct值就滞后1个循环到达2023/10/29相对定量（Relativequantification）是计算要处理样本相对于正常（内参基因）样本的基因表达量变化，属于倍数关系式，扩增效率达到100%时用2-∆∆CT法来分析处理实验数据。实验过程中还要引入一个或多个内参基因进行校正和标准化。内参基因（Referencegene）是指在不同类型细胞、不同实验处理条件下恒定表达的一类管家基因，常用的内参基因有b-actin、GAPDH、18sRNA、efla等。2023/10/210

相对定量分析方法12-ΔΔCt

前提：目标序列和内参序列的扩增效率接近100％且偏差在5％以内。1．计算ΔCt：ΔCt=Ct靶基因－CtGAPDH，分别计算实验组和对照组的ΔCt。2．计算ΔΔCt：ΔΔCt=ΔCt实验组－ΔCt对照组。3．计算相对表达量的差值。2－ΔΔCt靶基因AGAPDHΔCt对照组实验组

相对定量分析方法2：双标准曲线法

前提：目标基因与内参基因扩增效率不同

待测样品目的基因浓度

待测样品内参基因浓度

F=对照样品目的基因浓度对照样品内参基因浓度二、基因表达分析的具体步骤1