血红蛋白的提取分离DNA的粗提取与鉴定课件

DNA的粗提取与鉴定提取生物大分子的基本思路是，选用一定的物理或化学方法分离具有不同物理或化学性质的生物大分子。提取DNA就是利用DNA与RNA、蛋白质、脂质等理化性质的差异去除杂蛋白。DNA和蛋白质等其他成分在不同浓度NaCl溶液中溶解度不同，因此可以选择适当盐浓度使DNA充分溶解，使杂质沉淀，或者相反以达到分离的目的。进一步分离DNA和蛋白质，可利用DNA不溶于酒精，某些蛋白质溶于酒精的原理。DNA的粗提取与鉴定进一步分离DNA和蛋白质，可利用DNA不13.蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA无影响；多数蛋白质不能忍受60~80℃

的高温，而DNA在80℃以上才会变性。洗涤剂能瓦解细胞膜，但对DNA没有影响。在沸水浴条件下，DNA遇二苯胺会被染成蓝色。

4.DNA粗提取与鉴定，四个主要的实验步骤：

步骤目的①实验材料的选取——鸡血细胞DNA丰富②破碎细胞获取含DNA的滤液③去除滤液中的杂质纯化DNA④DNA的析出与鉴定鉴定DNA5.选取实验材料，原则上凡是含有DNA的生物材料都可以考虑，为提高实验的成功率要选用DNA含量相对较高的生物组织，如鸡血细胞、洋葱等。破碎动物细胞常用蒸馏水，用玻璃棒搅拌后收集滤液。破碎植物细胞需先用洗涤剂、食盐，再进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集滤液。3.蛋白酶能水解蛋白质,但对DNA无影响；多数蛋白质不能忍26.破碎细胞后获取的滤液可能含有核蛋白、RNA、多糖等杂质。可根据DNA的不同性质除去这些杂质：方法原理操作NaCl溶液分离法酶解分离法高温变性分离法DNA与蛋白质等杂质在不同浓度NaCl溶液中的溶解度不同2mol/LNaCl溶液溶解DNA0.14mol/LNaCl溶液析出DNA蛋白质酶分解蛋白质不影响DNA滤液中加嫩肉粉（木瓜蛋白酶

）10~15min蛋白质在60~80℃大多变性DNA80℃以上变性60~75℃保温10~15min6.破碎细胞后获取的滤液可能含有核蛋白、RNA、多糖等杂质37.进一步提纯DNA并使其析出可用体积分数95%、冷却的酒精，然后用玻璃棒沿一个方向搅拌，卷起丝状物，滤纸吸去上面的水分，鉴定DNA用二苯胺试剂。对照组的操作是：2mol/L的NaCl溶液5ml,加入4ml二苯胺，沸水浴5min，冷却后试管颜色：无色。8.注意：鸡血中加3g柠檬酸钠防止血液凝固；加洗涤剂后要轻缓柔和，否则容易产生大量泡沫；玻璃棒搅拌要轻缓以免加剧DNA分子断裂，不能形成絮状沉淀；二苯胺要现配先用，否则会影响鉴定效果；提取器具最好用塑料烧杯，因为DNA容易被玻璃器皿吸附。7.进一步提纯DNA并使其析出可用体积分数95%、冷却的酒精4血红蛋白的提取分离DNA的粗提取与鉴定课件5血红蛋白的提取和分离从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常用的方法有酶解法、超声波法、研磨法。分离不同种类蛋白质的依据是蛋白质各种特性的差异，如分子的形态和大小，所带电荷的性质和多少、溶解度、吸附性质和对其他分子的亲和力等。凝胶色谱法又叫分配色谱法。是根据相对分子量大小分离蛋白质的有效方法。构成凝胶球体的成分大多数是多糖类化合物，球体内部有许多贯穿的通道，小分子蛋白质因易进入凝胶内部的通道，路程较长，移动速度较慢，后从层析液中洗脱出来，大分子蛋白质无法进入凝胶内部，只在凝胶珠间隙移动，路程较短，所以首先洗脱出来。血红蛋白的提取和分离从细胞中提取蛋白质，首先要使细胞破碎，常6血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细胞白细胞血小板红细胞（最多）血红蛋白（90％）两个α－肽链两个β一肽链四个亚铁红素基团2.

血液有哪些成分？

1.

用鸡的红细胞提取DNA，用哺乳动物的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？

鸡的红细胞具有细胞核，含有DNA，便于进行DNA的提取；人的红细胞无细胞核，结构简单，血红蛋白含量丰富，便于提取血红蛋白。血液血浆水分其他物质：血浆蛋白、无机盐、磷脂、葡萄糖等血细7

二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理：（一）蛋白质提取和分离步骤（二）操作过程

可选用猪、牛、羊或其他脊椎动物的血液来分离血红蛋白。(1)红细胞的洗涤:①洗涤目的:

去除杂蛋白，以利于后续血红蛋白的分离纯化，洗涤次数不可过少。②洗涤操作：

1、采集血样。2、低速短时间离心（速度越高和时间越长，会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀，达不到分离的效果）3、吸取血浆：上层透明的黄色血浆。4、盐水洗涤：用五倍体积的质量分数为0.9％的氯化钠溶液洗涤。5、低速离心（低速短时间）6、重复4、5步骤三次，直至上清液中已没有黄色，表明洗涤干净。二、实验操作样品处理→粗分离→纯化→纯度鉴定1.样品处理8初次离心后的结果初次离心后的结果93次洗涤后的结果3次洗涤后的结果10(2)血红蛋白的释放：

加蒸馏水到原血液体积，再加40％体积的甲苯，置于磁力搅拌器上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白。(3)分离血红蛋白溶液：

①过程：将搅拌好混合液转移到离心管内，以2000r/min的速度离心10min。②试管中溶液层次：第1层（最上层）：甲苯层（无色透明）；第2层（中上层）：脂溶性物质沉淀层（白色薄层固体）；第3层（中下层）：血红蛋白的水溶液层（红色透明液体）；第4层（最下层）：杂质沉淀层（暗红色）。③分离：用滤纸过滤，除去脂溶性沉淀层，于分液漏斗中静置片刻后，分出下层的红色透明液体。

二、实验操作(2)血红蛋白的释放：加11(4)透析：

①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，将透析袋放入盛有300ml的物质的量浓度为20mmol/l的磷酸缓冲液中（pH为7.0），透析12小时。②透析目的：除去样品中分子量较小的杂质。

二、实验操作原理：透析袋能使小分子自由进出，而大分子保留在袋内。缓冲液能够抵制外界酸和碱对溶液pH的影响，维持pH基本不变。它通常由1~2种缓冲剂制成，这样可以在实验条件下准确模拟生物体内天然环境。(4)透析：①过程：取1ml的血红蛋白溶液装入透析袋中，12利用透析袋透析利用透析袋透析13透析过程动画演示透析过程动画演示14凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：

①取长40厘米，内径1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。②底塞的制作：打孔→挖出凹穴→安装移液管头部→覆盖尼龙网，再用100目尼龙纱包好，插到玻璃管的一端。注意事项：底塞中插入的玻璃管的上部不得超出橡皮塞的凹穴底面，否则难以铺实尼龙网，还会导致液体残留，蛋白质分离不彻底。③顶塞的制作：打孔→安装玻璃管。④组装：将上述三者按相应位置组装成一个整体。⑤安装其他附属结构。凝胶色谱操作:（1）凝胶色谱柱的制作：①取长40厘米15装配好的凝胶柱注意：1、液面不要低于凝胶表面，否则可能有气泡混入，影响液体在柱内的流动与最终生物大分子物质的分离效果。2、不能发生洗脱液流干，露出凝胶颗粒的现象。装配好的凝胶柱注意：16（2）样品加入与洗脱

①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱内缓冲液缓慢下降到与凝胶面平齐，关闭出口。

②滴加透析样品：吸管吸1ml样品加到色谱柱的顶端，滴加样品时，吸管管口贴着管壁环绕移动加样，同时注意不要破坏凝胶面。

③样品渗入凝胶床：加样后打开下端出口，使样品渗入凝胶床内，等样品完全进入凝胶层后，关闭下端出口。

④洗脱：小心加入pH=7.0的20mmol/l的磷酸缓冲液到适当高度，连接缓冲液洗脱瓶，打开下端出口进行洗脱。⑤收集：待红色的蛋白质接近色谱柱底端时，用试管收集流出液，每5ml收集一试管，连续收集。（在分离过程中，如果红色区带均匀一致的移动，说明色谱柱制作成功）⑥注意：正确的加样操作：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。（2）样品加入与洗脱①调节缓冲液面：打开下端出口，使柱17样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶面。2、贴壁加样。3、使吸管管口沿管壁环绕移动。样品加入与洗脱注意：正确的加样操作是：1、不要触及并破坏凝胶18收集得到的纯化后的蛋白收集得到的纯化后的蛋白194.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程4.凝胶色谱法分离蛋白质的原理和具体过程20

蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带净电荷的多少以及分子的大小等因素。为了消除净电荷对迁移率的影响，可以在凝胶中加入SDS1.原理：聚丙稀酰胺凝胶电泳

SDS能使蛋白质发生完全变性。由几条肽链组成的蛋白质复合体在SDS的作用下会解聚成单条肽链，因此测定的结果只是单条肽链的分子量。SDS能与各种蛋白质形成蛋白质—