胃肠道菌群分子研究进展

胃肠道菌群分子研究进展

通常，母乳胃（包括人类）的肠道有大约400种细菌，总共超过1014种，其中大多数是严格的厌氧菌。这些微生物在养分、生理和免疫方面发挥着重要作用。近年来,人们发现胃肠道正常菌群与人类及动物的健康有密切关系,如乳酸菌、产丁酸菌能促进肠道健康等,因而关于人类及动物胃肠道微生态的研究日益为人们所重视。胃肠道微生态研究的主要内容有:(1)定性、定量分析胃肠道中的微生物;(2)微生物之间及与宿主的关系;(3)微生物的活性功能。传统上,研究胃肠道微生态主要依靠培养技术。虽然在过去近半个世纪里传统技术取得了重大进展,如厌氧培养技术的发明,动物模型的建立以及无菌动物的应用等,然而胃肠道中可培养的细菌占总细菌的比例仍然只是少数,其主要原因有:很多细菌的生长需要的未知性,各种细菌对培养基不同的选择性,体外培养过程对微生物的应激性,严格厌氧技术的困难性,微生物之间以及与宿主细胞间相互作用的复杂性等。最近10多年中,一种基于16S核糖体RNA(rRNA)的序列多态性的分子生物学技术正被广泛应用于各种生态系统中的菌群研究,也包括哺乳动物的胃肠道微生态系统。116srrna分子技术的应用在生物进化的漫长过程中,rRNA分子保持相对恒定的生物学功能和保守的碱基排列顺序,同时也存在着与进化过程相一致的突变率,在结构上可分为保守区(conserveddomain)和可变区(variabledomain),其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16SrRNA长约1540bp,结构和碱基排列复杂度适中,较易于进行序列测定和分析比较。基于16SrRNA的这些特点,我们可以简单地认为一个16SrRNA的基因序列就代表着一种原核生物,而基于16SrRNA(rDNA)的分子技术也正是建立在这一认识基础上的。。通过比较各类生物16SrRNA的基因序列,从序列差异计算它们之间的进化距离,可以绘出生物进化树。研究者通过对人的粪便、结肠和回肠样品的16SrDNA建立基因克隆文库,发现很大一部分细菌在以前的研究中都被忽略[5～7],在其它动物肠道样品中也发现这一现象[8～10]。尽管对16SrRNA基因序列的克隆、测序提供了更多不可培养微生物的信息,但该方法不能定量,而且是建立在PCR基础上的。有研究表明,要使16SrDNA基因克隆文库真正反映样品情况,PCR的循环数应尽可能减小。216srdna指纹技术利用指纹技术研究菌群组成已被证实是可行的,而且该技术非常适合于研究微生态系统中菌群的变化,通过比较指纹图谱我们很容易了解不同个体或者不同胃肠道生境的菌群组成差异。变性梯度凝胶电泳(denaturinggradientgelelectrophoresis,DGGE)是常用的一种16SrDNA指纹技术,首次被用于微生态研究是分析海水生态系统中的细菌组成,继而该技术及相似的温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis,TGGE)已被广泛用于其它微生物生态系统研究。用于研究微生物群落的传统指纹技术有单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism,SSCP)和末段限制性长度多态性(terminal-restrictionfragmentlengthpolymorphism,T-RFLP)。这些研究微生态多样性的指纹技术都是基于PCR基础上的,特异性的扩增产物代表着微生态系统中的微生物多样性,在电泳胶上形成指纹的主要原理是:DGGE,TGGE主要根据扩增产物不同的解链特性,SSCP主要根据单链DNA的二级结构,而T-RFLP主要根据限制酶的特异作用位点。目前,DGGE、TGGE分析小亚基rDNA已经被成功应用于人类及其它动物[14～16]的胃肠道菌群研究。报道表明DGGE,TGGE最低能检测到占菌群总细菌数1%的细菌,这说明只有微生态系统中的优势菌才能被研究到。Zoetendal等最初利用TGGE指纹技术比较成人粪便菌群发现优势菌群具有宿主特异性,并且这一现象在其它年龄层次的人及其它动物(如猪)的粪样中也存在,这表明胃肠道中菌群具有宿主特异性是普遍现象。Zoetendal等还利用DGGE技术比较无亲缘关系的人之间以及同卵双胞胎之间胃肠道菌群发现,同卵双胞胎之间的DGGE图谱的相似性显著高于无亲缘关系的人之间,这说明胃肠道的优势菌群受遗传的影响。动物的胃肠道微生态系统是非常复杂的,不同的胃肠道生境的菌群结构也是不同的,研究发现人结肠粘膜上的细菌菌群在整个结肠分布是一致的,但和粪便的菌群有很显著的差异,这表明通过分析粪便样本不能完全反映其它肠断样本的情况。16SrDNA指纹技术还适合于人类胃肠道中某一类菌群的研究,研究者根据原核生物16SrDNA序列进化的种属特异性设计出了针对某一种属细菌的特异性引物,通过PCR就可以将这一类细菌的16SrD-NA的片段序列扩增出来。Favier等研究了新生儿肠道中双歧杆菌的发育变化,结果表明母乳喂养有利用双歧杆菌在婴儿体内更早定值,并且双歧杆菌的定值受遗传因素和环境因素的影响。Heilig等研究了人体内的乳酸杆菌菌群,发现五月龄前婴儿体内的乳酸杆菌是连续变化的,而成人体内乳酸杆菌菌群的稳定性因人而异。16SrDNA指纹技术还可以用于研究日粮成分对动物胃肠道菌群的影响[18,23～25],结合序列分析技术,我们就可以从微生物角度了解日粮成分对动物机体的作用机理。316pcr扩增产物的定量检测DNA指纹技术反映菌群的多样性主要在定性方面,而要全面了解微生态系统,我们还必须从定量方面作研究。PCR是一种非常敏感的技术,它能够检测到来自环境中微生物的极低浓度的核酸,基于PCR的定量分析小亚基rDNA技术正被广泛应用。竞争性(C-)PCR最初用于定量人类细胞的mRNA,基本原理是通过在模板中加入一种特殊的已知浓度的模板同时进行PCR扩增,根据两者扩增产物的长度不同利用琼脂糖电泳检测灰度,从而达到定量的目的。Pintado等发现将竞争性PCR与DNA指纹技术(DGGE,TGGE)结合也可用于菌群定量分析,这种技术的优点是待测模板与竞争性模板的PCR扩增产物可以有相同的长度,而且可以在菌株水平上定量。最大可能计数(MPN-)PCR也是一种定量分析细菌小亚基rDNA技术,已成功用于分析动物粪便样品。它的基本原理与MPN细菌计数方法相似,通过对模板作梯度稀释,进行PCR扩增,该技术能定量分析大多数种类的细菌,但对复杂菌群分析应用较少。另外一种定量PCR技术是实时(RealTime-)荧光定量PCR,该技术能监测整个PCR过程中的产物含量,真正反映产物含量与模板浓度直接关系,因而具有很高的准确度。尽管是否适合于复杂菌群的研究还有待进一步验证,但该技术在很低模板浓度下就能进行准确定量这一特点是其它方法无法比拟的。目前,该技术已成功用于人类、仔猪肠道及反刍动物瘤胃菌群等方面的研究中[26～28]。斑点杂交技术也可用于定量测定特异16SrRNA的相对量。它的基本原理是将样品的RNA先固定至固体支持物,再与带有定量信号标记的寡核苷酸探针杂交,该技术不涉及到PCR扩增,因此具有很高的精确度。4fish技术荧光原位杂交技术是常用的以16SrRNA为目标的非培养细菌计数技术。它根据不同种属细菌的16SrRNA中的特异性片段设计探针,以荧光作为信号,杂交后在荧光显微镜下对相应的细菌计数。目前,研究者已设计出了许多不同细菌的特异性探针,包括Bacteroides,Bifidobacterium,Streptococcus,Lactobacillus,Collinsella,Eubacterium,Fusobacterium,Clostridium,Veillonella,Fibrobacter,Ruminococcus[29～34]。FISH技术主要应用于以下几个方面:(1)同时鉴定自然生态系统中的不同菌群,并且确定它们的定值位点;(2)通过使用套式探针,获得菌群结构信息;(3)了解培养中的问题;(4)原位了解细胞中rRNA含量;(5)对特定的细菌准确计数。但是,该技术对粪样细菌计数的最低数量是106/g。将FISH与流式细胞计数相结合被证实是一种很有用的技术,因为该技术可以将不可培养的细菌分类继而进行分子技术研究。5基因芯片技术目前一种检测生态中菌群的新方法———基因芯片技术正被广泛使用,该技术是采用光导原位合成或微量点样等方法,将大量DNA探针如基因、PCR产物、人工合成的寡核苷酸等有序地固定在载体表面,形成储存有大量信息的高密度DNA微阵列。该微阵列与标记的核酸样品杂交后,能快速、准确、大规模地获取样品核酸序列信息。最初该技术是用来检测生长细胞中某些基因的表达,随后发现该技术也适合各种生态系统中菌群研究。Wang等建立了人胃肠道中40种主要细菌的基因芯片鉴定技术,在医学方面该技术也已被广泛用于致病菌的鉴定。基因芯片技术最关键的两个问题是探针的特异性和定量信号的灵敏性,为了解决这些问题,Chandler等构建出一个能有效克服二级、三级结构影响的双探针体系(twoprobeproximalchaperonedetectionsystem),能有效防止空间结构(碱基堆积)对杂交的影响,并且显著提高单碱基错配的鉴别能力。Busti等设计了种特异性的连接酶检测反应(1igasedetectionreaction,LDR)探针,其中每一对探针由鉴别寡核酸探针(discriminatingoligoprobe)和通用探针(commonprobe)组成,该方法能有效地分辨各菌种间16SrDNA单个碱基的差别。6其它功能基因检测对菌群结构的分析是研究胃肠道生态系统的第一步,但对于复杂的胃肠道微生态系统,它只是提供了有限的信息,我们还必须对该系统中的各种细菌的功能做深入了解。如在临床检测病原菌上,将基于16SrDNA的PCR技术与病原菌的耐药性基因检测相结合,更能准确地对病原菌进行鉴定。而某些功能性细菌(如乳酸菌、丁酸菌)可能属于不同的种属,因此很难直接用16SrDNA序列进化进行分类,而结合它们功能基因的检测就可以更全面了解它们之间地进化关系。人类后肠中的大量微生物代谢碳水化合物产生的丁酸能为能源被结肠上皮细胞利用,并且还能减少后肠疾病(如结肠炎、结肠癌)的发生。丁酸激酶是丁酸产生过程中的关键酶,丁酸激酶基因的检测已被用来鉴定产丁酸菌。体外表达技术是另外一种原位检测基因表达的方法,该方法最先用来研究病原菌基因的表达,最近被用来筛选鉴定能诱导Lactobacillusreuteri在大鼠胃肠道中定植的活性物质。近来,研究者利用细菌人工染色体(bacterialartificialchromosomeBAC)载体来寻找功能基因,BAC载体能携带很大的DNA片段(>100kb)进行克隆,已有研究者对土壤及海水生态系统建立了克隆基因文库。