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实验三蛋白质定量分析——双缩脲法

【目的要求】1.掌握双缩脲法测定蛋白质含量的实验原理、技术和特点意义。2.掌握运用标准曲线法求算待测溶液的浓度3.进一步巩固分光光度计和刻度吸管的使用【实验原理】双缩脲反应：方法灵敏度时间原理干扰物质说明凯氏定氮法（Kjedahl法）灵敏度低，适用于0.2~1.0mg氮，误差为

2％费时8～10小时将蛋白氮转化为氨，用酸吸收后滴定非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）用于标准蛋白质含量的准确测定；干扰少；费时太长双缩脲法（Biuret法）灵敏度低1～10mg中速20~30分钟多肽键＋碱性Cu2＋

紫色络合物硫酸铵；Tris缓冲液；某些氨基酸用于快速测定，但不太灵敏；不同蛋白质显色相似紫外吸收法较为灵敏50～100

g快速5～10分钟蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收各种嘌吟和嘧啶；各种核苷酸用于层析柱流出液的检测；核酸的吸收可以校正Folin－酚试剂法（Lowry法）灵敏度高～5

g慢速40～60分钟双缩脲反应；磷钼酸－磷钨酸试剂被酪氨酸和苯丙氨酸还原硫酸铵；Tris缓冲液；甘氨酸；各种硫醇耗费时间长；操作要严格计时；颜色深浅随不同蛋白质变化考马斯亮蓝法(Bradford法)灵敏度最高1～5

g快速5～15分钟考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时，其

max由465nm变为595nm强碱性缓冲液；TritonX-100;SDS最好的方法；干扰物质少；颜色稳定；颜色深浅随不同蛋白质变化1.加液

取10mL试管7支，标明管号，按下表所示，加入试剂。【操作步骤】

管号试剂0123456酶蛋白标准蛋白溶液（mL）10mg/mL—0.20.40.60.81.0—待测蛋白液（mL）——————1.0蒸馏水（mL）1.00.80.60.40.2——蛋白质浓度（mg/mL）02.04.06.08.010.0未知各管混匀后加入双缩脲试剂4.0ml，充分混匀；室温（20-25度）20min；在540nm处以0号管调零点测定各管吸光度；绘制标准曲线：以吸光度为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标；对照标准曲线，求待测蛋白质浓度。作图

以各管蛋白质浓度（mg/mL)为横坐标，吸光度(A540)为纵坐标，选择适当的纵横坐标分度值，在座标纸上便可绘出一条蛋白质双缩脲剂量的反应标准曲线（standardcurve)。注意事项

1.用移液管准确移取溶液，可以采用差量法，溶液尽量放入试管底部。

2.试管应编号，注意加样顺序，不要漏加。

3.测定所加入的蛋白质量应在标准曲线范围之内。

管号吸光度（A540)0123456A1A

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