葛根芩连汤复方大鼠血浆hplc指纹图谱研究

葛根芩连汤复方大鼠血浆hplc指纹图谱研究

中药的成分非常复杂。服用后，经过一些生物转化，现有的成分转化为活性物质，一些代谢失去了活力，一些通过身体的神经液调节系统发挥了作用。因此，服用中药后的化学成分变化过程是有效中药基本物质的重要组成部分。而基于进入血液的成分才有可能成为有效成分的观点,日本学者提出了“血清药化学”,主要研究血清中的化学物质,观测血清中外源性活性物质及其作用和代谢规律。我国学者王喜军等进行了大量的实践工作,提出了“中药血清药化学”的概念,并成功地完成了茵陈蒿汤的生物药学研究,也对六味地黄丸的血清药化学进行了研究。葛根芩连汤源于《伤寒论》,处方由葛根、甘草、黄芩、黄连组成,具有轻清解肌、清热止利功效。目前,对葛根芩连汤的成分及药效研究较多,但大多数研究只限于成分的定性、定量分析及中药配伍的影响,对葛根芩连汤体内的血清药化学报道较少。本研究通过对葛根芩连汤入血成分的详细研究,初步确定其入血成分、代谢产物的归属,对大鼠灌胃葛根芩连汤的血清药化学进行了初步探索,为进一步研究葛根芩连复方的效应物质奠定了基础。1材料表面1.1实验设备岛津高效液相色谱仪(日本岛津公司),包括LC-20AB泵,SPD-20A检测器、DGU-20A3脱气仪和LCsolution工作站;5417R小型台式高速冷冻离心机(德国Eppendorf公司);KQ2200B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司);SHB-Ⅲ型循环水多用真空泵(郑州长城科工贸有限公司);旋转蒸发器RE-52AA(上海振捷实验设备有限公司);DRT-TW型调温电热套(郑州长城科工贸有限公司);PB-10玻璃膜电极pH计(德国Sartorius公司)。1.2-2005葛根素、黄芩苷、小檗碱、巴马汀、药根碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号110752-200511,110715-200514,110713-200208,110732-200506,0733-20005);葛根、黄芩、黄连、甘草(上海市闵行区雷允上药店);乙腈、甲醇(色谱纯,Tedia公司);水(娃哈哈纯净水);其余试剂为市售分析纯。1.3动物健康SD大鼠(250±20)g,雄性,上海西普尔-必凯实验动物有限公司提供,合格证号SCXK(沪)2003-0002。2方法和结果2.1样品制备2.1.1根、现场同法同法单次论按《伤寒论》处方组成及比例称取各单味药,即葛根10g、黄芩6g、黄连6g、甘草4g于烧杯中,先将10g葛根浸泡在200mL水中20min,其余3味药则浸泡在300mL水中。将葛根液加热煮沸20min后加入剩余3味药,加热回流沸腾30min,将药液倒出;加入水2次回流30min,2次共加水1000mL,合并2次煎液,过滤浓缩至1mL含生药0.60g,供灌胃用。另取葛根、黄芩、黄连、甘草同法单煎配制,浓缩到1mL含生药0.23g葛根水煎液、0.14g黄芩水煎液、0.14g黄连水煎液、0.09g甘草水煎液,供灌胃用。精取上述浓缩液各0.5mL至50mL量瓶中,加入甲醇稀释定容,溶液过0.45μm微孔滤膜,供HPLC分析。2.1.2对照品溶液的制备称取对照品葛根素、黄芩苷、小檗碱、巴马汀、药根碱各1mg,分别置于5mL量瓶中,加甲醇溶解并稀释成0.2g·L-1的对照品溶液。2.1.3-内酰胺水浴制备取SD大鼠,按照15mL·kg-1体重,分别灌胃给予蒸馏水、葛根芩连水煎液及各单味水煎液,每日2次,连续给药3d,末次给药30min后取血,离心20min(7000r·min-1),取上清液0.1mL,加入0.1mL的0.1mol·L-1醋酸铵溶液,涡旋后加入8倍量甲醇,涡旋5min,离心10min(1万r·min-1),上清液在40℃水浴中用N2吹干。残渣用0.1mL甲醇复溶,以12000r·min-1离心5min,上清液作为空白血浆及给药后含药血浆的样品。2.2或洗脱乙腈,脱腈,超声资金流程,有GlobalsilC18色谱柱(4.6mm×250mm,5μm,带保护柱,苏州环球色谱有限公司)。流动相A为20mmol·L-1乙酸铵水溶液,B为乙腈,梯度洗脱,0～15min,10%～15%B;15～20min,15%～16.5%B;20～48min,16.5%～22.7%B;48～55min,22.7%～24%B;55～65min,24%～30%B;65～70min,30%B;70～78min,30～50%B;78～88min,50～80%B;88～90min,80%B。流速1.0mL·min-1;柱温为室温;进样量为20μL,检测波长270nm。2.3指纹图谱相似度评价取6只大鼠灌胃葛根芩连复方水煎液后,将给药后30min含药血浆的色谱图进行色谱指纹图谱相似度分析(中药色谱指纹图谱相似度评价系统研究版2004A),获得其共有峰。2.3.1方法的精密度取30min含药血浆按照2.1.3项处理后,连续进样5次,测得各共有峰相对保留时间的RSD<1.7%,相对峰面积比值的RSD<17%,表明精密度良好。2.3.2hplc稳定性取同一供试品溶液分别于0,2.5,5,7.5,10,24,48h进样分析,HPLC测得各共有峰相对保留时间的RSD<2.1%,相对峰面积比值的RSD<18%,表明样品在48h内稳定。2.3.3重复性检测取同一组含药血浆,按2.1.3方法平行制备5份供试品溶液,分别进行HPLC分离和检测,测得各共有峰相对保留时间的RSD<3.6%,相对峰面积比值的RSD小于16%,表明方法的重复性良好。2.4血液中向转移的组成分析2.4.1葛根现有样品的前处理在空白血浆中加入葛根芩连水煎液,按照2.1.3方法处理,可看出空白血浆中的内源性物质不干扰复方组分的分离,且复方所含成分的数目和相对含量在经过样品处理前后没有发生变化,说明本实验选用的甲醇沉淀蛋白,然后甲醇复溶血浆样品的样品前处理方法是合适的,不影响实验结果的客观性,且优化的色谱分离条件也能满足实验的要求(图1)。取6只大鼠灌胃葛根芩连复方水煎液后,将给药后30min含药血浆的色谱图与空白血浆色谱峰比较,发现葛根芩连水煎液给药后,含药血浆经HPLC检测出31个移行成分。进一步将给药后的含药血浆与空白血浆加葛根芩连水煎液的色谱图比较,发现1,3,4,5,12,14,19,20,23,25,26,27,29,30,31为葛根芩连汤复方所含的成分直接吸收入血;2,6,7,8,9,10,11,13,15,16,17,18,21,22,24,28为复方代谢产物或复方给药后出现的新物质。而葛根芩连水煎液中的Y1,Y2,Y3,Y4,Y5在含药血浆中并未检测到,可能含量很低或是未吸收进入血浆(图1)。2.4.2药物代谢产物的检测经与复方、单味药体内外谱图比较,分析血中移行组分归属:1,3,4,5,27号峰为葛根所含成分直接入血而成,与对照品比较,3号峰为葛根素;2,15,18号峰由于在葛根体外图谱中未见这3种成分,而体内图谱中却出现了,故推断可能为葛根代谢产物(图2);12,14,19,20,23号峰为黄芩所含成分直接入血而成(图3),经对照品比较,14号峰为黄芩苷,21,22,24号峰在复方和黄芩单煎液给药后的体内图谱中均出现,而在体外图谱中未出现,推测为黄芩的代谢产物;25,30,31号峰为黄连所含成分直接入血而成(图4),经对照品比较,25,30,31号峰分别为药根碱,巴马汀和小檗碱;26号峰在黄连水煎液和复方含药血浆中检测到,而黄连单煎含药血浆中未能检测到。由于葛根芩连方剂配伍可加速小檗碱体内的代谢,使血药浓度达峰时间提前,而黄连主要含生物碱类,故推测26号峰的性质与小檗碱相似;而在相同的取血时间,单煎给药后此物质在血浆中的浓度低于复方给药后的血浆浓度,因此有可能低于紫外检测限而无法在单煎给药后的血浆色谱图中找到。29为甘草直接入血成分(图5),6,8,10,11,13,17,28为甘草代谢产物。方剂配伍能够引起煎煮体系物理化学性质的改变,从而增加或减少某些成分的溶出度,甚至产生新的物质。按照上述煎煮及分离检测方法,葛根芩连水煎液的色谱峰均能在单味药中找到相应归属(图6),并未出现新的物质。而7,9,16号对应色谱峰(图1)在单味葛根、黄芩、黄连、甘草体内外图谱中均未找到,只在复方水煎液灌胃后才出现,初步推断为复方灌胃后才出现的血中新物质。表1总结了葛根芩连入血成分色谱图初步归属结果。3复方水教育中氟含量的检测实验中比较了复方含药血浆在250(葛根素和甘草酸最大吸收波长),254,270(小檗碱等生物碱最大吸收波长),280(黄芩苷最大吸收波长),360nm(甘草某些成分的最大吸收波长)这5个波长下的色谱图,发现270nm波长下检测的色谱峰高低比例比较均匀、基线平稳,且能最大程度反映葛根芩连中所含的化学信息,因此确定270nm为检测波长。葛根芩连汤以葛根为君方,黄芩、黄连为臣药,甘草为使药,其中葛根、黄芩和黄连中主要指标性成分分别为葛根素、黄芩苷和小檗碱,对应的色谱峰为3,14,31(图6)。复方煎煮过程中各单味药化学成分相互作用产生沉淀,如甘草酸和含有葡萄糖醛酸酐的黄芩苷与小檗碱作用产生沉淀等,使得葛根、黄芩、甘草的配伍降低小檗碱的含量,黄连降低了黄芩苷的含量。这虽然导致复方煎煮后标志性成分有所降低,但从复方水煎液HPLC色谱峰的高度来看(图6),这三者仍可作为其标志性成分。在血样的采集过程中,有学者提出血浆比血清更接近体内的实际情况,因为在凝血的过程中激活或是释放的酶可能会对中药有效成分具有降解作用,某些中药成分还可能会被吸附,并发现复方五仁醇胶囊主要入血成分在大鼠血浆中的量均高于血清。为比较血浆和血清成分的差异,本实验在同一时间点分别采集血浆和血清,在同一色谱条件下比较得血浆包含色谱峰稍微更多些,所以在比较单方和复方给药后入血成分时均采用含药血浆。大鼠灌胃给药30min的血浆中检测到葛根素、黄芩苷和小檗碱,三者的含量差异很大,这主要是因为不同物质在体内代谢过程不同所致。谭晓梅等测定葛根芩连汤和葛根单煎剂中兔血中的葛根素含量,发现灌胃给药后葛根素的达峰时间分别为28,24min;灌胃黄芩水煎液后黄芩苷出现双峰现象,首个达峰浓度为10～30min;灌胃给药后小檗碱的达峰时间则为2h。因此,给药后30min取血,体内黄芩苷和葛根素接近峰值,含量较大;而小檗碱在体内的代谢缓慢而检测微小。实验中同时也比较了给药后60,90,120,180min的色谱图,发现给药30min血浆的色谱图能最大程度地反映复方水煎液的入血成分,所以综合比较最终选定30min为采血点。葛根芩连汤所含成分复杂,反复优化选取色谱条件,结果能分离较多的组分,在此基础上测定葛根芩连汤的HPLC图,并与各单味药样品色谱图比较,发现它们有很强的相关性。将各含药血浆与空白血浆样品作对照,初步定性葛根芩连复方灌胃后的入血成分。根据保留时间对各色谱峰进行归属,发现入血物质除了煎剂本身的成分还包括给药后的代谢产物,并且复方给药后产生了单方都没有的新物质,这从某种程度上说明复方配伍的意义。血浆成分分析存在着含量低、组分多、分离难的特点,特别是生物体存在