蛋白质离子交换层析介质的分子模拟方法

蛋白质离子交换层析介质的分子模拟方法

决定生物分离过程效率的内在因素是生物分子和分离材料之间的分子相互作用。借助现代分子模拟技术和生物大分子结构数据资源,构筑合适的机理模型,可以加强分离过程中微观分子相互作用的认识,从而促进分离过程优化和分离材料设计。基于静电相互作用的离子交换层析是应用最广泛的蛋白质层析分离技术,规模化应用的成果层出不穷,也建立了不少层析分离模型。然而,微观分离本质认识的不足造成了模型分析普遍缺乏预见性,难以预估蛋白质分子在层析床层中的分离行为。针对这一状况,国外学者尝试引入分子模拟方法来考察蛋白质分离过程中的静电相互作用,取得了一些进展。然而,微观分子模拟计算往往与宏观的分离行为相脱节,使得分子模拟计算的结果难以获得应用。本文借助分子模拟技术来研究离子交换层析中蛋白质和功能配基间的静电相互作用,以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶为模型对象,构筑合适的蛋白质-介质配基模拟表面,通过分子模拟计算表征静电相互作用的能量参数,寻求静电相互作用能和层析停留因子间的相关性,实现微观分子模拟计算和宏观分离现象的定量关联。1材料和方法1.1pdb平台获得以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶作为研究对象。蛋白质的三维结构数据从ProteinDataBank(PDB)数据库获得,通过比较分析,选择PDBID为1lse(蛋清溶菌酶)和2cga(牛胰凝乳蛋白酶)的三维结构数据。蛋白质大小分别为43×10-10m(蛋清溶菌酶)和50×10-10m(牛胰凝乳蛋白酶)。1.2离子液体辅助的双向水合合法成效特点采用程序包MCCE、Delphi和GRASP等进行分子模拟计算。MCCE程序用于研究pH变化对于蛋白质分子中氨基酸残基质子化的影响,获得不同pH条件下的蛋白质三维结构数据。Delphi程序用于研究离子浓度对蛋白质周围静电势的影响。采用点电荷模拟功能配基,形成离子交换剂内孔配基模拟表面,构筑蛋白质-介质配基模拟表面体系。采用基于Poission-Boltzmann方程的Delphi程序计算蛋白质和模拟配基表面间的静电相互作用能,考察配基平面大小、配基密度、作用距离、作用方向、盐浓度、pH等影响。2结果与讨论2.1阳离子交换接枝基于文献数据,计算了4种阳离子交换剂的性质,包括GEHealthcare公司的SPSepharoseFF、CMSepharoseFF和TOSOH公司的ToyopearlSP650M、ToyopearlCM650M结果见表1。介质孔径范围在2.5～8×10-8m之间,平均配基距离在6～8×10-10m之间。介质的平均孔径远大于蛋白质的大小,因而介质孔可以近似作为平面以简化计算。另外,蛋白质大小明显大于平均配基距离,也就是说一个蛋白质可以和很多数量的配基发生相互作用。为简化处理,配基间距设定为7×10-10m。由于不同阳离子交换介质的结构是类似的,功能基团的顶部带一个负电荷,如磺酸基、磺丙基、羧甲基、羧基等,而空间臂上所带电荷较少。因此,本文将阳离子交换基团简化为带一个负电荷的原子,构筑点电荷网平面来模拟配基表面,根据蛋白质对象大小调整平面,配基间距均为7×10-10m。与溶菌酶作用的模拟平面是9×9配基组成,平面边长为5.6×10-9m,略大于溶菌酶的直径(4.3×10-9m);与牛胰凝乳蛋白酶作用平面是10×10配基组成,边长为6.3×10-9m,略大于牛胰凝乳蛋白酶的直径(5×10-9m)。2.2蛋白质-模拟介质平面相互作用模拟组成蛋白质的氨基酸电荷有差别,蛋白质表面氨基酸的分布也不同,因而蛋白质表面电荷特性存在明显的区域分布,与模拟介质平面的相互作用会随着作用方向的变化而改变。图1和2分别给出了两个蛋白质和模拟配基平面相互作用能随作用方向变化情况。结果表明,配基平面在Z方向340°与溶菌酶作用能最大,而Z方向10°时牛胰凝乳蛋白酶作用能最大。这两个最强相互作用方向作为后续计算的基础,以考察其它因素的影响。2.3平面距离变化的模拟考察了最强作用方向时结合能随蛋白质与配基模拟平面距离变化的情况(见图3)。随着间距的增大,两者之间的结合能逐渐减小,而且成线性关系,该结果与文献报道相符。2.4盐浓度对结合能的影响离子交换层析分离蛋白质,一般在低盐浓度上柱,采用增大盐浓度实现蛋白质的洗脱。本文考察了盐浓度对结合能的影响,如图4所示。在低浓度时,结合能与盐浓度的对数值之间呈现线性关系,当盐浓度较高时,结合能达到一个稳定值。通过观察电势图发现,随着盐浓度增大,蛋白质周围静电势明显减小,导致结合能显著变小。2.5不同ph下盐浓度对蛋白质-介质模拟平面间结合能的影响通过MCCE程序获得蛋白质在不同pH条件下表面氨基酸残基的带电性。选取最强相互作用方向,计算了不同pH下盐浓度对蛋白质-介质模拟平面间结合能的影响(如图5)。随pH增大,蛋白质表面正电荷减少,因此与带负电荷的介质模拟平面的结合能显著减弱,分子模拟计算的结果与层析规律相一致。2.6凝乳蛋白酶表达对阳离子交换层析的影响DePhillips等曾考察了多种蛋白质在阳离子交换层析中保留行为,提供了层析过程的的保留因子数据。采用其中的蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶在阳离子交换层析中保留因子数据,计算平衡常数,与相应条件下的分子模拟获得的结合能进行关联,结果如图6、7。能量参数与平衡常数之间存在明显的线性关系,特别在低盐浓度。然而,不同介质显示不同的关联规律,强离子交换剂比弱离子交换剂具有更强的保留行为,表明采用带有相同点电荷的模拟介质表面存在一定的局限性,无法描述配基间的差别,进一步考虑配基原子构成和电荷分布将改进计算结果。3离子化功能配基的模拟以蛋清溶菌酶和牛胰凝乳蛋白酶为模型蛋白质,阳离子交换吸附剂SPSepharoseFF等为模型层析介质。通过分析介质孔径和配基分布,采用点电荷模拟离子化功能配基,构筑蛋白质-介质配基模拟表面体系。运用基于Poission-Boltzmann方程的Delphi程序计算蛋白质和模拟配基表