离体诱导的离体挥发性类合成分子调控机制研究

离体诱导的离体挥发性类合成分子调控机制研究

阳春沙是中国沙接受治疗的主要品种之一。干燥、成熟的水果具有除湿、健胃、加热和松弛胎儿的作用。砂仁芳香化湿、行气止痛的主要药效物质是挥发油,而挥发油中的挥发性萜类主要由单萜、倍半萜及其含氧衍生物组成。阳春砂中含量较高的挥发性萜类成分有乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、蒎烯、柠檬烯和芳樟醇等[3~5]。茉莉酸甲酯(MethylJasmonate,MeJA)是一种新型的植物激素,在植物的生长发育和防御反应中发挥着重要作用。同时,MeJA是一种重要的非生物诱导子,也是植物次生代谢中重要的信号转导分子[6~8]。通过信号转导,MeJA可以激活或抑制相应转录因子的活性,进而调控与植物次生代谢相关的关键酶基因的表达,影响关键酶的活性,从而调控次生代谢产物的合成。本课题组前期研究了MeJA喷施阳春砂幼苗对萜类合成关键酶基因AvHMGR、AvDXR和AvDXS表达量的影响,发现MeJA对AvHMGR和AvDXR的表达有显著的促进作用。此外,用200μmol·L-1MeJA对阳春砂成苗进行诱导,发现AvHMGR和AvDXR基因的表达量在一定时间内有所增加,单萜类化合物的含量受MeJA诱导而提高,而倍半萜类化合物的含量则在短暂提高后呈现下降,说明MeJA能够诱导阳春砂相关功能基因的表达及萜类化合物含量的变化。以上结果为本文的研究提供了重要思路。本文通过不同浓度(0、200、600μmol·L-1)MeJA诱导处理阳春砂不同部位(叶片和果实),分析了MeJA诱导处理24h后阳春砂果皮和种子团中挥发性萜类成分的变化情况,并初步分析了MeJA诱导后阳春砂转录组测序结果中萜类代谢相关的注释数据,这些研究为探明MeJA调控萜类化合物的代谢机制及提高阳春砂的药效品质奠定了基础。1材料和方法1.1吸附剂和试剂所用阳春砂材料种植于广东省阳春市蟠龙镇,经广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心杨锦芬研究员鉴定为阳春砂AomomumvillosumLour.。茉莉酸甲酯(纯度≥95.0%,HPLC,美国Sigma公司);吐温-80(广州健阳生物科技有限公司);石油醚(60℃~90℃,HPLC,天津福晨化学试剂厂);柠檬烯对照品(纯度≥99.0%,美国Sigma公司);MAS-II型常压微波合成/萃取反应工作站(上海新仪微波化学科技有限公司);HP6890/5973GC/MS联用仪(美国Agilent公司);N-1100减压旋转蒸发仪(上海爱朗EYELA)。1.2实验方法1.2.1阳春砂的喷施和推行将长势相近的果实成熟期阳春砂植株随机分为喷施果实组和喷施叶片组,然后分别用浓度200μmol·L-1和600μmol·L-1的MeJA溶液(以含有0.02%吐温-80的纯水为溶剂)喷施阳春砂植株的叶片和果实,同时设空白组(未喷施任何溶液)和溶剂组(含0.02%吐温-80的纯水),喷施后立即用薄膜套袋,于喷施后24h采集果实,每个采样时间点设置3个生物学重复。新鲜果实采摘后立即简单清洁,液氮冷冻,-80℃保存。1.2.2微波合成/萃取将阳春砂鲜果分为果皮和种子团,在液氮冷冻下分别研磨成粉末状,精确称量3.00g,转移至带塞三角瓶中,加入30mL石油醚,加塞密封。常温浸泡10min后,放入MAS-II型常压微波合成/萃取反应工作站中,43℃、800W提取5min。提取后过滤,滤液40℃减压旋转蒸发至烧瓶内余2~3mL浓缩液时,转移至容量瓶,定容至5mL。每个样品平行提取2份。1.2.3worm-ms分析条件1.2.3.高纯抗钢绞线过滤法色谱柱为DB-FFAP毛细管柱(30m×0.25mm×0.25μm);载气为高纯氦气,载气流量为0.7mL·min-1;进样口温度:250℃;程序升温:50℃起始,保持1min;10℃·min-1升温至100℃,保持1min;再以20℃·min-1升温至220℃,保持13min;进样量1.0μL;分流比10∶1。1.2.3.离子源温度和接口温度离子源为EI源,电子能量70eV;离子源温度230℃;接口温度:280℃;溶剂延迟1min;质量扫描范围:29.0~500.0amu。1.2.3.挥发性类化合物的质谱鉴定通过Wiley7n.L和Nist08.L质谱数据库检索,并结合质谱图解析及相关文献,确认各峰对应的挥发性萜类化合物。以柠檬烯为标准品,外标法定量,计算公式:C样=A样×C标/A标(C样为样品浓度;C标为对照浓度;A样为样品峰面积;A标为对照峰面积)。1.2.3.统计学分析采用SPSS17.0统计软件进行数据的统计学分析,所得数据用平均数表示,多个样本均数的比较采用单因素方差分析(One-WayANOVA)。1.2.4de开发及测序转录组测序样品为MeJA喷施后阳春砂果实和叶片的混合样品,包括200μmol·L-1MeJA喷施果实24h后采收的果实、600μmol·L-1MeJA喷施果实24h后采收的果实、200μmol·L-1MeJA喷施果实48h后采收的果实、600μmol·L-1MeJA喷施果实48h后采收的果实以及200μmol·L-1MeJA喷施叶片24h后采收的叶片。提取样品的总RNA后,构建测序文库,用IlluminaHiSeq2000进行测序,转录组测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。测序完成后,进行Denovo序列组装,将原始图像数据经Basecalling转化为相应的核苷酸序列数据(Rawreads),对Rawreads进行去除杂质处理得到Cleanreads。使用短reads组装软件Trinity做转录组从头组装,依次得到Contigs、Scanfold和Unigene。2结果与分析2.1复合喷果剂对挥发性类成分积累的影响果皮中共检测到20种挥发性萜类成分,其中单萜及其衍生物13种,倍半萜及其衍生物7种,芳樟醇、β-蒎烯、α-蒎烯和乙酸龙脑酯的含量较高,见表1。与空白组相比,溶剂组中有17个化合物的含量降低,其中有13个具有显著差异。与溶剂组相比,200μmol·L-1MeJA组中有9个化合物的含量升高,其中6个化合物的含量显著升高,尤其以α-蒎烯、β-蒎烯和桧烯升高明显;有11个化合物的含量降低,其中9个有显著差异,而乙酸龙脑酯、龙脑和樟脑的含量降低尤为显著。同时,与溶剂组相比,600μmol·L-1MeJA组中有19个化合物的含量升高,其中14个有显著差异,其中α-蒎烯、β-蒎烯和柠檬烯的含量显著升高。而与200μmol·L-1MeJA组相比,600μmol·L-1MeJA组中有19个化合物的含量升高,其中13个有显著差异,乙酸龙脑酯、龙脑和樟脑含量升高的幅度较大。由此可见,与溶剂组和200μmol·L-1MeJA组相比,600μmol·L-1MeJA喷果24h后果皮中大部分挥发性萜类成分的积累量明显增加,说明600μmol·L-1MeJA喷果24h能够显著促进挥发性萜类成分的合成。此外,与200μmol·L-1MeJA喷叶组相比,200μmol·L-1MeJA喷果组中有7个化合物的含量升高,其中4个有显著差异,而有13个化合物的含量降低,其中9个有明显差异。且200μmol·L-1MeJA喷叶组果皮中的乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑和大牻牛儿-1,6-二烯-5-醇的含量明显高于喷果组,喷果组果皮中芳樟醇、α-蒎烯、β-蒎烯和桧烯的含量显著高于喷叶组(表2),说明200μmol·L-1MeJA喷施不同部位对果皮中不同挥发性萜类成分含量的影响存在明显的差异。2.2moll-fmeja对k-ras-ms/ms之间的化合物含量的影响种子团中共检测到33种挥发性萜类成分,其中单萜及其衍生物14种,倍半萜及其衍生物19种,乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑、柠檬烯和双环大根香叶烯的相对含量较高;尤其乙酸龙脑酯和樟脑的相对含量可分别达5.0~7.0g·kg-1和2.0~2.7g·kg-1,见表3。与空白组相比,溶剂组中有24个化合物的含量降低,其中6个有明显差异。与溶剂组相比,200μmol·L-1MeJA组中有20个化合物的含量降低,其中16个有显著差异,而600μmol·L-1MeJA组中有13个化合物的含量变化有显著差异,其中9个化合物的含量降低,4个化合物的含量升高;与200μmol·L-1MeJA组相比,600μmol·L-1MeJA组中有17个化合物的含量升高,其中9个有明显差异。这些结果说明,不同浓度MeJA诱导处理阳春砂的果实24h后,对种子团中部分挥发性萜类成分的合成表现出一定的抑制作用,但随着MeJA浓度的升高其抑制作用逐渐减弱。此外,200μmol·L-1MeJA喷叶组和喷果组中乙酸龙脑酯、樟脑、龙脑和双环大根香叶烯的含量均较高,说明200μmol·L-1MeJA喷施不同部位24h后,对种子团中挥发性萜类成分的影响较一致,可能是由于MeJA诱导处理果实或叶片后均为间接作用于种子团中挥发性萜类成分的合成和积累。与200μmol·L-1MeJA喷叶组相比,200μmol·L-1MeJA喷果组中有25个化合物的含量升高,其中13个有显著差异,而有8个化合物的含量降低,说明喷果比喷叶更能提高种子团中挥发性萜类成分的积累量,见表4。2.3meja诱导下的阳春砂转录组数据MeJA诱导后阳春砂转录组测序共获得68168个Unigene,N50为747bp,GC含量为46.58%。将获得的Unigene与Nr、SwissProt、KEGG、COG和GO数据库做blast比对,共有48627个Unigene获得基因注释,注释率为71.33%。其中有15481个Unigene归入122条KEGG路径中,与次生代谢相关的代谢通路有19条,而与萜类化合物生物合成相关的代谢通路有8条,含有477个Unigene。对MeJA诱导后的阳春砂转录组数据进行深入分析,发现与挥发性萜类代谢密切相关的Unigene有208个,其中萜类骨架合成通路中注释到了萜类生物合成上游和中游的大部分编码基因,而单萜合成通路中注释到了4个编码基因,倍半萜合成通路中注释到了2个编码基因。此外,还发现与JA信号转导密切相关的MYC2类转录因子Unigene22个。与未用MeJA处理的阳春砂转录组数据相比,MeJA诱导后的阳春砂转录组数据中U-nigene的分布更具有指向性,代谢路径和次生代谢物生物合成路径中包含的Unigene最多,占注释总量的36.19%(如表5),说明MeJA诱导后有较多的Unigene参与代谢路径和次生代谢物的生物合成;并且,MeJA诱导后的阳春砂转录组数据中单萜和倍半萜生物合成相关的Unigene得到更多的注释(如表6),说明MeJA诱导可引起阳春砂转录水平的改变,进而影响下游萜类化合物的生物合成。这些代谢通路的注释信息为研究阳春砂中挥发性萜类化合物生物合成的分子机制、发掘新的关键功能基因提供了重要线索和依据。3meja对挥发性类合成的调控本研究中用200、600μmol·L-1MeJA分别处理阳春砂的叶片和果实,24h后检测果皮和种子团中的挥发性萜类成分变化,并进行转录组测序。结果显示,α-蒎烯、β-蒎烯、桧烯、柠檬烯、乙酸龙脑酯和双环大根香叶烯是果皮和种子团中共有的挥发性萜类成分,但其含量相差较大。果皮中检测到20种挥发性萜类成分,600μmol·L-1MeJA喷果24h后果皮中挥发性萜类成分的积累量明显增加;种子团中检测到33种挥发性萜类成分,200μmol·L-1MeJA喷施不同部位24h后对种子团中挥发性萜类成分的影响较一致,且200μmol·L-1MeJA喷施果实比喷施叶片更能提高种子团中挥发性萜类成分的积累量,说明阳春砂的不同部位对不同浓度MeJA的诱导具有不同的响应。MeJA作为诱导子已应用于许多药用植物的次生代谢调控研究。朱宏涛等用不同浓度MeJA处理三七组培苗,发现250μmol·L-1MeJA处理的样品中总皂苷含量高达10.05%,是对照样品的16.8倍,且总皂苷含量呈现先升后降、最后达到相对平衡的规律。李明等分别用5个不同浓度的MeJA溶液喷施丹参种苗,结果表明丹参种苗经MeJA喷施后48h内其茎叶中丹酚酸和丹酚酸B含量均高于对照,且随浓度的升高而含量增加。本研究中也发现高浓度的MeJA溶液能够显著提高果皮和种子团中大部分挥发性萜类成分的含量。FatemehRF等测定了不同浓度MeJA处理不同时间后茴藿香挥发油组成和含量的变化,确定0.1mmol·L-1MeJA处理48h时挥发油含量最高(2.42%),且爱草脑积累量最多(97.6%)。朱金荣等研究发现薄荷喷施MeJA后,相同类型组成的薄荷单体成分的相对含量出现了规律性变化,如薄荷中多数倍半萜类、脂肪族类及芳香族类成分的相对含量呈下降趋势,并推测多数同分异构体的单萜成分在MeJA的作用下发生了相互转化。以上研究表明,MeJA诱导能够有效提高药用植物中挥发性萜类成分的含量,而本研究结果还表明化学结构相近的化合物受MeJA诱导后其变化趋势亦相似,如龙脑和异龙脑、蒎烯和莰烯等。为了进一步了解MeJA调控阳春砂挥发性萜类合成的分子机制,本研究将MeJA诱导后的阳春砂的果实和叶片进行了转录组测序。Uningene注释结果显示,MeJA诱导后有较多的Unigene参与了次生代谢物的生物合成,并且单萜和倍半萜生物合成相关的Unigene也得到了更多的注释。而对萜类代谢通路进行深入分析,发现了多个萜类合成相关的候选基因。SunG等为了全面了解MeJA对红豆杉中紫杉醇生物合成的调