生物化学教学课件：SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）Sodiumdodecylsulfatepolyacrylamidegelelectrophoresis一.实验目的

1.学习SDS测定蛋白质分子量的原理

2.掌握垂直板电泳的操作方法

二.实验原理SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳:是在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠）1967年，Shapiro等人首先发现，如果在聚丙烯酰胺凝胶电泳(聚丙烯酰胺凝胶中主要取决于三种因素：蛋白大小，形状和电荷)系统中加入一定量的十二烷基硫酸钠（SDS），则蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于蛋白质的分子量大小？SDS的作用SDSisastrongdetergentagentusedtodenaturenativeproteinstounfolded,individualpolypeptides.Whenaproteinmixtureisheatedto100°CinpresenceofSDS,thedetergentwrapsaroundthepolypeptidebackbone.Itbindstopolypeptidesinaconstantweightratioof1.4gSDS/gofpolypeptide.Inthisprocess,theintrinsicchargesofpolypeptidesbecomesnegligiblewhencomparedtothenegativechargescontributedbySDS.Thuspolypeptidesaftertreatmentbecomerod-likestructurespossessingauniformchargedensity,thatissamenetnegativechargeperunitlength.Theelectrophoreticmobilitiesoftheseproteinswillbealinearfunctionofthelogarithmsoftheirmolecularweights.

当蛋白质的分子量在15,000－200,000之间时，样品的迁移率与其分子量的对数呈线性关系。符合如下方程式：lgMW=－b

m+K

其中，MW为蛋白质的分子量，m相对迁移率，b为斜率，K为截距。当条件一定时，b与K均为常数因此通过已知分子量的蛋白与未知蛋白的比较，就可以得出未知蛋白的分子量SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS)按照缓冲液的pH值和凝胶孔径的差异及有无浓缩效应分为连续系统和不连续系统两大类连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场作用下，主要靠电荷和分子筛效应不连续系统中由于缓冲液离子成分，pH，凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还具有浓缩效应，因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳Gel5%10%15%294566972002945669720029456697200Ammonium(AP)

(N2H8S2O8;MW:228.2).APSisasourceoffreeradicalsandisoftenusedasaninitiatorforgelformation.TEMED(N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine)(C6H16N2;MW:116.21).TEMEDstabilizesfreeradicalsandimprovespolymerization

垂直板电泳装置加样样品迁移方向电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。混合样品带孔胶

按分子大小分离电泳方向

电泳

小分子大分子夹在两块玻璃板之间的凝胶

电泳缓冲液

电泳缓冲液

加在槽中的经SDS处理的样品分子量小分子量大电源电泳后的凝胶径考马斯亮篮染色、脱色后的凝胶照片标准蛋白分子量未知蛋白在一定的凝胶浓度下，多肽链分子量的对数与多肽链的相对迁移率成线性关系，所以可以通过标准曲线求未知多肽链分子量。

相对迁移率水平式电泳装置电泳缓冲液凝胶操作过程1.将玻璃板用蒸馏水洗净晾干

2.把玻璃板在灌胶支架上固定好(放好密封条和隔离板)

*固定玻璃板时，两边用力一定要均匀，防止夹坏玻璃板

分离胶(12%)浓缩胶(5%)ddH2O4.3ml2.37ml40%Acr3.0ml0.5mlBuffer1.5mol/LpH=8.8Tris-HCl2.5ml0.5mol/LpH=6.8Tris-HCl1.0ml10%SDS0.1ml40µl10%Ap0.1ml40µlTEMED4µl4µl

配胶3.按比例配好分离胶,用移液枪快速加入（或直接用小烧杯倒入）,大约5厘米左右,之后加少许蒸馏水（或异丙醇除泡）,静置至胶凝

*凝胶配制过程要迅速,催化剂TEMED要在注胶前再加入,否则凝结无法注胶。注胶过程最好一次性完成,避免产生气泡*水封的目的：保持分离胶上沿平直，排气泡,加速聚合.

*胶凝好的标志：胶与水层之间形成清晰的界面

4.倒出水并用滤纸把剩余的水分吸干,按比例配好浓缩胶,连续平稳加入浓缩胶至边缘处,迅速插入梳子,静置到胶凝

*梳子需一次平稳插入,梳口处不得有气泡,梳底需水平

5.拔出样梳后,拆掉密封条，在内槽中加入缓冲液*用吸瓶将加样孔内和玻璃板下面放密封条位置的气泡全部排出6.上样：（1）marker10µl

（2）样品（100℃沸水浴，3-5min处理并离心，蛋白变性）

7.微量注射器（加样器）上样,上样量10-15µl

*微量注射器不可过低,以防刺破胶体；也不可过高,样品下沉时易发生扩散，溢出加样孔8.电泳槽中加入缓冲液，接通电源，进行电泳，溴酚蓝距凝胶边缘约数cm时，停止电泳

9.凝胶板剥离与染色：电泳结束后，撬开玻璃板，将凝胶板做好标记后放在大培养皿内，加入考马斯亮蓝染色染色液，染色20-30min左右

10.脱色：染色后的凝胶板用蒸馏水漂洗数次，再用脱色液脱色，直到蛋白质区带清晰

*剥胶时要小心,保持胶完好无损,染色要充分

11.实验结果分析注意的问题

蛋白质电泳常用的SDS：单一亚基组成的蛋白质非变性PAGE：多个不同亚基组成的蛋白质

聚丙烯酰胺具有神经毒性，操作时要戴手套试剂1.40%丙烯酰胺（Acr）：2.10%SDS（十二烷基硫酸钠）3.1.5mol/LpH8.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8，最后用蒸馏水定容至100ml4.0.5mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8，最后用蒸馏水定容至100ml

（7）10%过硫酸铵(AP)

（8）TEMED（四甲基乙二胺）

（9）样品溶解液：

SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+溴酚蓝（2mg）+甘油（2g）+0.05mol/LpH8.0Tris-HCl（2ml），最后定容至10ml。

（10）染色液：称取考马斯亮蓝R2500.125g