PRRS实验室诊断监测

PRRS实验室诊断监测技术

-----RT-PCR检测技术

黑龙江省动物卫生监督所主要内容PCR技术PRRSVRT-PCR

检测技术动物病毒的组成两部分1.蛋白质：HA、HI、ELISA2.核酸：分为两种脱氧核糖核酸（DNA）---PCR核糖核酸（RNA）---RT-PCR

PRRS病毒粒子的结构PCR技术概念

PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程的核酸扩增技术，它以待扩增的两条DNA链为模板，由一对人工合成的寡核苷酸引物介导，通过DNA聚合酶酶促反应，快速体外扩增特异DNA序列。

PCR技术简史1971年，Khorana提出：经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。但由于测序和引物合成的困难，对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现，寡核苷酸引物的合成仍处在手工、半自动合成阶段

所以，Khorana的设想被人们遗忘了……PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善PCR技术简史PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善1985年，美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR）基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制最初采用大肠杆菌DNA聚合酶进行PCR，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，90℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的DNA片段不均一。PCR技术简史1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaquaticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0Kb)。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也大大提高。

PCR的最初设想PCR的实现PCR的改进与完善基本原理适量的缓冲液,微量的模板DNA,四种脱氧单核苷酸,耐热性多聚酶,一对合成DNA的引物,通过高温变性、低温退火和中温延伸三个阶段为一个循环,每一次循环使特异区段的基因拷贝数放大一倍,一般样品是经过30次循环,最终使基因放大了数百万倍;扩增了特异区段的DNA带。1234522557294时间（min）温度（℃）适温延伸3高温变性1低温退火2重复1~3步25~30轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍PCR反应条件1）PCR反应成分（1）模板单、双链DNA均可。不能混有蛋白酶，特别是染色体中的组蛋白、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、DNA结合蛋白类。一般100ngDNA模板/100L。模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。（2）引物浓度0.1-0.5mol/L浓度过高易导致模板与引物错配,反应非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。（3）Taq

DNA聚合酶0.5-2.5U/50l酶量过高可引起反应非特异性扩增;酶量过少则合成产物量减少。（4）dNTPdNTP浓度取决于扩增片段的长度四种dNTP浓度应相等，如果有一种浓度不同于其他几种，就会引起错配。浓度过高易产生错误碱基的掺入，浓度过低则降低反应产量dNTP可与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度下降，影响DNA聚合酶的活性。（5）Mg2+Mg2+是DNA聚合酶的激活剂。0.5mmol/L-2.5mmol/L反应体系。Mg2+浓度过低会使Taq酶活性丧失、PCR产量下降；Mg2+过高反应特异性降低，出现非特异扩增。Mg2+可与负离子结合，所以反应体系中dNTP、EDTA等的浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。2）循环参数变性一般情况下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA变性，若低于93℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温环境对酶的活性有影响。此步若不能使靶基因模板或PCR产物完全变性，就会导致PCR失败。(2)退火退火温度与时间，取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基序列的长度。引物的复性温度可通过以下公式帮助选择合适的温度：Tm值(解链温度)=4(G+C)＋2(A+T)

复性温度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允许范围内，选择较高的复性温度可大大减少引物和模板间的非特异性结合，提高PCR反应的特异性。复性时间一般为30～60sec，足以使引物与模板之间完全结合。

3）延伸PCR反应的延伸温度一般选择在70～75℃之间，常用温度为72℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PCR延伸反应的时间，可根据待扩增片段的长度而定。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。

（4）循环次数主要取决于模版DNA的浓度一般为25-35次次数过多：扩增效率降低错误掺入率增加PCR的特点特异性强PCR反应的特异性决定因素为：

①引物与模板DNA特异正确的结合；

②碱基配对原则；

③TaqDNA聚合酶合成反应的忠实性；

④靶基因的特异性与保守性。灵敏度高皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水平能从100万个细胞中检出一个靶细胞病毒检测的灵敏度可达3个PFU细菌检测的最小检出率为3个细菌简便、快速一次性加好反应液，2～4小时完成扩增扩增产物一般用电泳分析对标本的纯度要求低血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组织等组织的粗提DNAPCR的应用研究基因克隆，DNA测序，分析突变诊断细菌、病毒、寄生虫检测，基因诊断人类基因组工程遗传图谱的构建，DNA测序，表达图谱法医犯罪现场标本分析肿瘤各种肿瘤检测PRRSVRT-PCR

检测技术用途猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）反转录聚合酶链反应（RT-PCR）检测试剂盒，用于检测猪血清和组织中的PRRSV，适用于PRRSV的检测、诊断和流行病学调查。原理利用离心柱内硅基质膜提取RNA，在反转录酶的作用下，以RNA