微生物代谢工程

代谢工程

MetabolicEngineering代谢代谢途径是将一组特定的流入和流出代谢物质联系在一起的一个生化反应序列。代谢流(物流/通量)(flux)指流入代谢物经该途径转变为流出物的速率。通常，在一个特定的代谢途径中存在有控制该途径代谢流的关键位点，不同代谢途径之间通过相关联的节点连接在一起，从而在细胞内形成了代谢网络。代谢网络可视为由若干个串联或并联的简单子途径组成，它们通过节点相连。节点分为柔性、强刚性及弱刚性节点三类。所谓柔性节点，是指由节点流向各分支的代谢流量分割率随代谢要求发生相应的变化，去除产物的反馈抑制后，该分支的代谢流量分割率大大增加。所谓强刚性节点，是指由节点流向某一分支或某些分支的代谢流量分割率是难以改变的，这是由产物的反馈抑制及对另一分支酶的反式激活的相互作用所致。所谓弱刚性节点，是指介于前两者之间，由该节点流向各分支的代谢流中有一个是占主导地位的，其酶活较高或对节点代谢的亲和力较大，且无反馈抑制，通过削弱主导分支的酶量或酶活可增加产物的产率。C.glutamicumCCTCCM201005合成生物絮凝剂的代谢网络模型

代谢物流分析(metabolicfluxanalysis)：一种计算流经各种途径的通量的技术，用于描述不同途径的相互作用和围绕支点的物流分布。代谢控制分析(metaboliccontrolanalysis):物流控制被分布在途径的所有步骤中，只是若干步骤的物流比其他的更大些，可用数学方程来描述反应网络内的控制机制，即用一途径的物流和以物流控制系数来定量表示酶活之间的关系。物流控制系数(fluxcontrolcoefficient，FCC)是系统的性质，大体上可用物流的百分比变化除以酶活(该酶能引起物流的改变)的百分比变化表示。

物流求和理论(fluxsummationtheory)是如果将一代谢系统中的某一物流的所有酶的物流控制系数加在一起，其和为1。物流分担比(fluxsplitratio)是指途径A与途径B之比，如葡萄糖-6-磷酸节上的物流分担比便是EMP途径物流/(pp途径物流)。

弹性系数(elascitycoefficients)表示酶催化反应速率对代谢物浓度的敏感性。弹性系数是个别酶的特性。

在生物工程中通常是以生物细胞为反应器，利用其固有的代谢网络来合成所需的产物。由于遗传背景的限制，细胞固有的代谢网络常常很难满足人类的需要，这就促使人们进一步了解代谢网络，并在此基础上通过重组DNA技术来重新设计代谢途径，调整代谢网络，改造细胞原有特性以符合人类需要。代谢工程（metabolicengineering）途径工程（Pathwayengineering）利用重组DNA技术来对生物细胞内固有的代谢途径进行定向改造。(藉某些特定生化反应的修饰来定向改善细胞的特性或运用重组DNA技术来创造新的化合物。)

标志着基因工程应用已经进入到一个高级阶段。代谢工程的要素：

将分析方法运用于物流的定量化，用分子生物技术来控制物流以实现所需的遗传改造。代谢工程要解决的主要问题－

改变某些途径中的碳架物质流量或改变碳架物质流在不同途径中的流量分布提高细胞现存代谢途径中天然产物的产量；改造细胞现存代谢途径，使其合成新产物，这种新产物可以是中间代谢产物或修饰型的最终产物对不同细胞的代谢途径进行拟合，构建全新的代谢通路，从而产生细胞自身不能合成的新产物优化细胞的生物学特性，如生长速率、某些极端环境条件的耐受性代谢工程的本质应用重组DNA技术对细胞的酶反应、物质运输及调控功能进行遗传操作，从而改良细胞功能的技术。代谢工程涉及的主要内容生物合成相关代谢调控和代谢网络理论代谢流的定量分析代谢网络的重新设计中心代谢作用机理及相关代谢分析；基因操作代谢工程的研究目的通过重组DNA技术构建具有能合成目标产物的代谢网络或具有高产能力的工程菌并用于生产。代谢工程所采用的概念来自反应工程和用于生化反应途径分析的热力学。它强调整体的代谢途径而不是个别反应。代谢工程涉及完整的生物反应网络、途径合成的问题、热力学可行性、途径的物流及其控制。要想提高某一方面的代谢和细胞功能应从整个代谢网络的反应而不是一个个反应去考虑。重点应放在途径物流的放大和重新分配上。想通过单个酶的超表达来提高代谢途径的物流是行不通的，除非此酶具有高的物流控制系数。假定能成功超表达途径受限制的酶，该酶固然不再受反馈抑制，但瓶颈可能落在途径下游的酶上，从而导致代谢中间体的大幅度的增加。同时和协调地超表达途径中的大多数酶，原则上可大大提高代谢物流而不至于改变各代谢物的浓度。

另一种选择是增加途径产物的需求，这或许可通过提高产物的分泌速率办到。代谢工程研究的设计思路提高通向目标产物的代谢流扩展代谢途径构建新的代谢途径提高通向代谢产物的代谢流增强催化某反应的酶的表达量或活性，从而提高代谢流；在有竞争途径（如分支代谢途径）存在时，阻断有害的或无关的竞争代谢途径代谢产物的合成，从而达到改变代谢流，提高目标产物产量的目的。扩展代谢途径通过基因工程手段引入外源基因（簇）等，使原有代谢途径进一步向前或向后延伸，从而可利用新的原料用于合成目标产物或产生新的末端代谢产物。构建新的代谢途径构建新的代谢途径一般指引入外源基因（簇）来改造和修饰代谢网络，使细胞从不能合成某种代谢产物转变为能合成此代谢产物。常用手段：（1）转移代谢途径，即将多个特定代谢途径中的相关基因簇转移到无这些基因的菌株中，从而达到使其能合成新的目标产物的目的；（2）将无关的代谢途径相连，形成新的代谢途径，从而合成新的目标产物。代谢工程研究的基本程序改良靶点的确定基因操作效果分析改良靶点的确定合理的改良靶点的确定通常是建立在代谢网络的代谢流定量分析和控制分析的基础上。选择的靶点通常包括拟修饰的基因，拟导入代谢途径和拟阻断代谢途径的靶点等。基因操作一旦确定了靶点之后，需考虑采用适当的方法对靶基因进行遗传操作。常见的操作类型有：基因簇的克隆、表达、修饰、敲除、整合等。遗传操作是代谢工程研究的核心内容。但应注意掌握好对代谢网络进行修饰的强度，只有适度的修饰才能获得既不破坏细胞内的精细平衡状态，又能达到高产或合成新的目标代谢产物的目的。效果分析对构建的工程菌株的代谢网络进行全面的效果分析是必要的。效果分析显示出的问题往往又会成为新一轮实验的改进目标。经多轮遗传操作后，往往可获得优良的可用于生产的工程菌株。代谢工程应用研究进展————在微生物