亚细胞的分离

免疫荧光显微术Immunofluorescentmicroscope

荧光显微镜技术是根据标本本身的荧光反应物质具有吸收由荧光源发出的激发光能而呈现荧光的现象，或利用组织及细胞内某成分可与荧光染料结合，并受到荧光激发后呈现出特定颜色荧光的原理，用荧光显微镜进行观察，对待测物质进行定性、定量和定位的技术。免疫荧光（immunofluorescence，IF）定位是利用抗体与生物分子（抗原）的特异性结合，通过荧光结合抗体对抗原的特异性标记显现图像，从而对标本中的抗原进行定性、定量和定位。由于荧光与标本黑暗的背景对比强烈，所以荧光显微术的灵敏度非常高。荧光强度与激发光的量及荧光染料的量成线性比例关系，因此可以根据镜下荧光强度对标本中的抗原进行定量测定。目前，免疫荧光显微术已广泛应用于研究胚胎发育、病理组织、癌症及正常细胞表型，植物、真菌、细菌、病毒、亚细胞定位，以及抗原的辅助定位等。该技术的关键是抗体的特异性、标本的制备、自身荧光、显微镜的使用及操作者。抗体特异性取决于免疫时用的抗原的纯度，使用亲和纯化的多克隆抗体或单克隆抗体可以获得满意的结果。自身荧光通常限制细胞和组织中荧光抗体探针的可检测性。

通过光谱辨别（spectrumdiscrimination）可以将自身荧光的影响减至最低。光谱辨别包括选择适当的探针和滤光器以使探针的荧光信号相对于自身荧光之比达到最大。哺乳动物细胞中自身荧光物质主要是黄素辅酶（FDA和FMN，吸收光波长为450nm，发射光波长为515nm）和还原型吡啶核苷酸（NADH，吸收光波长340nm，发射光波长为460nm）。植物的自身荧光物质常是木质素，产生绿色荧光；卟啉，如叶绿素，产生长波长的红色荧光。因此，在IF中使用发射蓝光的短波长荧光染料比较好。对于固定细胞，在抗体孵育前先用含0.1％硼氢化钠的PBS溶液漂洗30min，可显著地减低自身荧光。1.荧光显微镜及其附属设备

荧光显微镜观察是在光学显微镜水平上对蛋白质和亚细胞组分进行定位的最常用的方法一。荧光显微镜由光源、滤片和显微镜三个系统组成。（一）光源荧光显微镜的光源系统是应用高压汞灯，该灯能以最小的表面积释放出最大量的短波光源（紫外线）。由启动装置控制，每次启动可工作2～3h。其使用寿命与启动次数、工作时间密切相关，故在使用时避免频繁启动而损坏电极。

（二）滤片系统滤片系统包括激发滤片、阻断滤片和吸热滤片。

1．激发滤片：大多以其所表现的光谱基本色调性质命名。（1）UV激发滤片激发光通常为波长365～400nm的紫外线。该滤片适于樱草素（primulin）、硫磺素（thioflavine）、Hoechst33258及Hoechst33342等荧光染色观察。（2）V干涉激发滤片：激发光为波长410～420nm的紫光。适于单胺类的荧光观察。（3）BV激发滤片：激发光为波长404～435nm的蓝紫光。适于吖啶橙及异硫氰酸荧光素（faluoresceinisothiocyanate,FITC）标记抗体的免疫荧光染色观察。（4）B干涉激发滤片：激发光为波长490nm的蓝光。也适于FITC标记抗体的免疫荧光观察。（5）G干涉激发滤片：激发光为波长520～550nm。适于四甲基异硫氰酸罗丹明（TRITC）标记抗体的免疫荧光染色观察。2.阻断滤片：在光路中吸收那些经过标本后未被标本转化，吸收而射到视野的激发光，起保护观察者眼睛的作用。激发与阻断滤片配合使用的范围。3.吸热滤片：由于光源都含有一定量的红光而产生热量，此类滤片具有吸收热量的作用。（三）荧光显微镜荧光显微镜依照光路照射方向分为透射式和落射式两种。大部分荧光显微镜兼有透射和落射两种功能。通过改变光路中的反光镜可以进行透射光或落射光荧光观察。2.抗体标记抗体与抗原的结合方法：直接法和间接法。直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。间接法是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。

图免疫细胞化学直接法（A）与间接法（B）示意图3.荧光染料

荧光染料是否发射荧光及荧光的强弱主要决定于该染料的分子结构，同时与其所处的环境及其状态也有密切的关系。如：染色液的pH、浓度和染色时的温度等均对荧光效应有一定的影响。在进行荧光染色时，还要注意避免与对荧光有淬灭作用的物质接触。例如卤酸盐，碘离子作用最强，其次为溴离子，而氯离子作用最小；金属离子，如铁离子、银离子等对荧光亦有淬灭作用。

荧光素是免疫荧光术中最常用的荧光染料，经紫外光（<400nm）或蓝光（常为490nm）激发后，发射出绿色荧光（500~550nm），其波长范围正是暗适应时眼睛最敏感的范围，而且显微镜的光学系统也能进行最佳校准。罗丹明、伊红、四甲基罗丹明、Texas红也是常用的荧光染料，其激发光波长为520~590nm，发射光波长为550~620nm，可通过一个异硫氰酸基团与抗体相连。一般来说，由于眼睛对黄光、红光比蓝光敏感，所以黄色和红色荧光染料比蓝色荧光染料更有用。蓝色荧光染料常需紫外线激发，还可能损伤许多细胞结构，并易使细胞产生自发荧光。

许多荧光染料也可与毒素结合。每种毒素特异性结合一种细胞靶结构，从而能够显示这些细胞结构。例如，荧光毒伞素用于标记细胞的丝状肌动蛋白（F肌动蛋白）。DAPI是用于荧光标记双链DNA最常用的荧光染料。图2（a）上皮细胞（b）细胞线粒体（c）肌动蛋白（d）HeLa细胞(AlexaFluor546共轭毒伞素)（e）非洲绿猴肾细胞肌动蛋白（f）棕榈树组织DAPI与A-T碱基结合后，其荧光比处于溶液中的自由状态或与G-C碱基结合的荧光强约20倍。DAPI可用于显示支原体污染及线粒体，但最常用于显示细胞核和染色体。缺点是，在多色成像中，用360nm的光激发时，DAPI发射的光太亮，从而掩盖了其他的荧光信号，可改用405nm的光作为激发光。长波长的光不仅能很好地激发DNA，还可减少对细胞的损害，而且也减少对其他荧光染料的漂白作用。由于DAPI有足够的明亮度，故仍是标准的DNA荧光染料。三、用酶标法检测细胞内蛋白质的定位（一）原理免疫酶标技术（ImmunoenzymaticTechnique）是指用酶标记抗体或酶标记抗抗体进行抗原－抗体反应。这种标记物可同时保留抗体的免疫特性和酶的活性。用酶标记抗体与抗原结合后，需再滴加酶的底物过氧化氢（H2O2）和供氢体二氨基联苯胺（diaminobenzidineterrahydrochloride，DAB）。酶和底物反应后可产生有色沉淀物，借助一般光学显微镜或电子显微镜进行定位、定性研究，也可应用光电比色计或酶标仪进行定量测定。采用酶检测法常遇到的问题及解决方法（1）内源性细胞酶活性的存在对反应结果的影响：虽然细胞内源性酶活性的问题并不是普遍存在，但有些细胞和组织有内源性的过氧化物酶（如巨噬细胞、骨髓细胞及红细胞）或碱性磷酸酶（如胎盘、小肠），这些内源性酶活性的存在会给实验结果的判定带来麻烦。

如果已知或怀疑存在内源性过氧化物酶活性，可以用含有1％乙酸的甲醇室温处理15min，或用含0.03％H2O2的甲醇室温处理30min。如果是经乙醛固定过