Chapter 04 基因组序列的功能解析

第四章

基因组序列的功能解析第一节在基因组中识别基因一、识别候选基因1.生物信息分析基因的序列特征双链DNA有6个ORFs阅读方式（1）开放阅读框架

(ORF，openreadingframe)从起始密码至终止密码（2）ORF的平均长度大肠杆菌：317个密码,酵母菌：483个密码,人：约450个密码.在原核生物中直接寻找ORF有效。在真核生物中不能直接寻找ORF。在真核生物中不能直接寻找ORF的原因：●62%的人类基因被间隔开●有内含子，断裂基因●许多外显子短于100个密码，甚至有些少于50个密码（3）对ORF扫描软件的修正1）密码偏爱在某种生物中并不是所有密码都被均等使用。2）外显子-内含子边界3）上游调控序列:CpG岛:40–50%的人类基因和脊椎动物基因中，5’上游的GC含量高4）寻找同源序列到其他模式生物中寻找同源序列。如果模式生物的同源序列已经被鉴定为某个功能基因的话…..主要用途是对新序列进行功能分析.2.通过实验技术识别基因

检测是否转录RNA分子.起始密码上游的数10个碱基，终止密码下游的上百个碱基.包括：（1）核酸杂交实验1）Northernblotting选择性剪接或者多基因家族都能产生多个RNA转录物mRNA一般都是从一个组织或器官中得到的2）zoo-blot(gardenblot）用Southernblot把一个物种的DNA片断与相关的其他物种的编码基因DNA杂交Probesample（2）cDNA测序（3）PCR技术从cDNA文库（cDNAlibrary）中筛选。1）RT-PCR(reversetranscriptasePCR)2）RACE(rapidamplificationofcDNAends)RACE（3）寻找外显子-内含子边界.1）mRNA-DNA杂交2）外显子捕获需要特殊的载体二、确定某个基因的功能1.生物信息学分析预测基因功能通过生物信息学分析和实验研究

.同源性查询:原理：功能相似的基因具有相似的序列（1）序列同源性反映了共同祖先的进化关系直系同源体（Orthologous）:来自不同的物种的同源基因旁系同源体（Paraloguos）:来自同一个生物的同源基因（2）同源性分析揭示基因或片断的功能可以分析DNA序列，但一般需要把DNA转化成氨基酸序列进行分析。核酸序列76%相同(偶然事件)氨基酸序列只有28%相同！1）完整序列比对2）部分序列分析寻找共同拥有的结构域（domain）.如tudordomain

结构域是序列功能的核心。（3）同源性分析在酵母基因组计划中的应用30%

是通过同源性分析预测的

酵母基因组含有约6000个基因,其中30%

是通过常规的遗传实验确定的.2.用实验确定基因功能（1）通过基因失活分析基因功能将基因突变，观察由此引起的表型变化。1）同源重组失活“Lossoffunction”酵母的删除盒用抗生素抗性基因替换酵母的某一处基因组序列基因敲除（knockout）小鼠胚胎干细胞（EScells）注射到小鼠胚胎嵌合体互相交配纯合体敲除小鼠有些基因是至死基因，只能得到杂合体2）非同源重组的基因失活1）转座子标签：把转座序列插入到基因中，使基因失活。让转座子带上应答元件，在外界的诱导下转座。缺点：不能准确失活一个基因，因为转座是个随机事件。人工诱导转座：给Ty1

的上游加上半乳糖诱导的启动子2）RNA干涉（RNAinterference）与目标基因序列互补的短双链RNA能降解目标基因的mRNA.在线虫1号染色体上，2769个预测的基因中的2500分别被进行了RNA干涉缺点：在哺乳动物中只能对单细胞进行处理，因为RNA在体内的存在时间有限。（2）通过基因超表达分析基因功能“Gainoffunction”3.未知基因编码的蛋白质功能的精细研究（1）定向突变删除或改变基因序列中的一部分Site-directedmutagenesis(体外定点突变):删除一段插入一段突变个别碱基

1）寡核苷酸定点突变2）同源重组导入突变基因

两步取代：第一步:用标记基因取代原基因第二步:用突变基因取代标记基因

失去标记获得标记（2）报告基因（Reportergenes）和免疫组织化学reportergenes举例确定基因表达的部位和时空特征.基因基因产物方法lacZ

β-半乳糖苷酶组织化学testuidA

β-葡糖苷酸酶组织化学testlux

荧光素酶生物发光GFP绿色荧光蛋白荧光1）报告基因2）免疫组织化学测定待测基因的启动子确定基因产物在细胞内的位置研究不同组织的不同发育阶段、不同疾病的转录物和翻译产物三、研究基因组的整体活性1.研究转录物组（1）基因表达系列分析（SAGE）鉴定细胞中的全部mRNA的相对丰度。③

把cDNA序列与基因组序列比较①把mRNA转为cDNA②

把cDNA文库中的每个克隆都测序转录物组学(transcriptomics)：是一门在整体水平上研究细胞中基因转录的情况及转录调控规律的学科.基因表达系列分析(SAGE)12-bp短序列足够特异412=16777216bpBsmFI切割10–14bp的下游.5′-AGCT-3