分子生物学实验步骤总结超全

一目的基因的获得细菌基因组DNA的提取仪器台式高速离心机恒温水浴箱枪式移液器灭菌的EP管和Tip头试剂溶液1:25%蔗糖50mmol/LTris-Hcl，pH8.050mmol/LEDTA，pH8.0500ug/ml溶菌酶〔现用现配〕100ug/mlRNase2)溶液Ⅱ：100mmol/LTris-Hcl，pH8.01%SDS400ug/ml蛋白酶K酚：氯仿：异戊醇〔25：24：1〕氯仿：异戊醇〔24：1〕3mol/LNaAc(pH5.2)异丙醇或无水乙醇70%乙醇8)TE缓冲液：10mmol/LTris-Hcl，pH8.01mmol/LEDTA，pH8.0实验步骤1)5mL细菌过夜培养，5000rpm离心10分钟，去上清液。将菌体细胞悬于250uL溶液1中，37°C水浴保温过夜。加250uL溶液Ⅱ，55°C水浴保温4小时。加0.9倍体积的酚/氯仿/异戊醇〔25：24：1〕，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤4一次。向转移的水相中参加0,9倍体积的氯仿/异戊醇〔24：1〕，轻轻混匀，于14000rpm离心10分钟，转移水相至新的Ep管，重复步骤5一次。向转移的水相中参加0.1倍体积的3mol/LNaAc和0.7倍体积的异丙醇〔或2.5倍体积的无水乙醇〕，冰上放置30分钟。14000rpm离心20分钟，弃上清，用0.5mL70%乙醇洗涤沉淀一次，弃上清，沉淀于室温枯燥。将DNA沉淀溶解于15ulTE缓冲液中，-20°C保存。进展DNA含量和纯度检测，琼脂糖凝胶电泳鉴定。植物DNA的SDS提取法：〔一〕试验试剂：1〕研磨缓冲液：称取59.63gNaCl，13.25g柠檬酸三钠，37.2gEDTA－Na分别溶解后合并为一，用0.2mol/L的NaOH调至pH7.0，并定容至1000ml。2〕10SSC溶液：称取87.66gNaCl和44.12g柠檬酸三钠，分别溶解，一起定容至1000ml。3〕1SSC溶液：用10SSC溶液稀释10倍。4〕0.1SSC溶液：用1SSC溶液稀释10倍。5〕Rnase溶液：用0.14mol/LNaCl溶液配制成25mg/ml的酶液，用1mol/LHCl，pH至5.0，使用前经80℃水浴处理5min〔以破坏可能存在的Dnase〕。6〕氯仿－异戊醇：按24ml氯仿和1ml异戊醇混合。7〕5mol/L高氯酸钠溶液：称取NaClO4．H2O70.23g，先参加少量蒸馏水溶解再容至100ml。8)SDS〔十二烷基硫酸钠〕化学试剂的重结晶：将SDS放入无水酒精中到达饱和为止，然后在70～80℃的水浴中溶解，趁热过滤，冷却之后即将滤液放入冰箱，待结晶出现再置室温下凉干待用。9)1mol／LHCl。10)0.2mol/LNaOH。11)二苯胺乙醛试剂：1.5g二苯胺溶于100ml冰醋酸中，添加1.5ml浓硫酸，装入棕色瓶，贮存暗处，使用时加0.1ml乙醛液［浓乙醛：H2O＝1：50〔V／V〕］。12)1.0mol/L高酸溶液〔HClO4〕。13)0.05mol/LNaOH。14)DNA标准液：取标准DNA25mg溶于少量0.05mol/LNaOH中，再用0.05mol/LNaOH定容至25ml，后用移溶管吸取此液5ml至50ml容量瓶中，加5.0ml1mol/LHClO4，混合冷却后用0.5mol/LHClO4定容至刻度，则得100μg/ml的标准溶液。〔二〕实验步骤：1)称取植物幼嫩组织10g剪碎置研钵中，加10ml预冷研磨缓冲液并参加0.1g左右的SDS，置冰浴上研磨成糊状。2)将匀浆无损转入25ml刻度试管中参加等体积的氯仿－异戊醇混合液，加上塞子，剧烈振荡30s，转入离心管，静置片刻以脱除组织蛋白质。以4000rpm离心5min。3)离心形成三层，小心地吸取上层清液至刻度试管中，弃去中间层的细胞碎片、变性蛋白质及下层的氯仿。4)将试管置72℃水浴中保温3min〔不超过4min〕，以灭活组织的DNA酶，然后迅速取出试管置冰水浴中冷却到室温，加5mol/L高氯酸钠溶液［提取液：高氯酸钠溶液＝4：1〔V／V〕］，使溶液中高氯酸钠的最终浓度为1mol/L。5)再次参加等体积氯仿－异戊醇混合液至大试管中，振荡1min，静置后在室温下离心〔4000rpm〕5min，取上清液置小烧杯中。6)用滴管吸95％的预冷乙醇，慢慢地参加烧杯中上清液的外表上，直至乙醇的体积为上清液的两倍，用玻璃棒轻轻搅动。此时核酸迅速以纤维状沉淀缠绕在玻璃棒上。7)然后参加0.5ml左右的10SSC，使最终浓度为1SSC。8)重复第6步骤和第7步骤即得到DNA的粗制品。9)参加已处理的Rnase溶液，使其最后的作用浓度为50～70μg/ml，并在37℃水浴中保温30min，以除去RNA。10)参加等体积的氯仿－异戊醇混合液，在三角瓶中振荡1min，再除去残留蛋白质及所加Rnase蛋白，室温下以4000rpm离心5min，收集上层水溶液。11)再按6、7步骤处理即可得到纯化的DNA液。PCR扩增目的基因器材微量移液器灭菌的Tip头、PCR管PCR扩增仪目的DNA〔DNA模板〕dNTP混合物引物对Tap酶PCR扩增试剂盒〔二〕试剂1〕10×PCR缓冲液〔含Tris-HCl100mmol/L;MgCl215mmol/L、KCl500mmol/L,pH8.3，0.1%明胶〕2)脱氧核苷三磷酸dNTPs：配成10mM——dATP，dTTP，dGTP，dCTP各10mM，用NaOH溶液调节至pH8.3。〕3〕氯仿-异戊醇：配成24：1的比例，室温避光保存。4)酚：氯仿：异戊醇=25：24：15)3MNaAc、ddH2O6)无水乙醇：70%乙醇7)TE缓冲液〔三〕实验步骤1〕在0.2ml薄壁反响管中参加以下成份：〔混匀〕ddH2O:补至终体积〔25μl〕10×PCR缓冲液1/10总体积2.0mMdNTPs1μl2U/μlTaqDNA聚合酶0.5μl引物混合液〔10pmol/μl/引物〕1μlDNA模板0.6μl混匀后，在台式离心机上瞬时离心10秒。2〕在设定好的PCR仪上反响95°C，5min；95°C，1min；56°C，1min；72°C，2min。反响30轮。3〕反响完毕后，将反响管在72°C充分延伸10分钟，再将反响管冷却至4°C。取一局部反响液进展琼脂糖凝胶电泳(实验三)，确认是否有目的的PCR产物。如果PCR产物纯度较低或反响液中含有连接反响阻碍物，可以通过纯化得到改善。纯化继续4〕—6〕。4〕转至1.5ml离心管，向管中加25μl酚，25μl氯仿-异戊醇混匀，离心10000rpm，30秒。5〕吸取上层液，转至另一已加5μl3MNaAc的1.5ml的离心管，加150μl无水乙醇，-20°C过夜。6〕离心10000rpm，10分钟，弃上清，加0.5ml70%乙醇，10000rpm离心，5分钟。弃上清，烤箱中干〔60°C〕，溶于20μlTE。〔四〕技术要点1〕PCR各组份的配制与加样量要特别注意。(1)引物浓度：10pmol足够30个循环，浓度太高导致与模板非特异结合增强，扩增非特异片段增多，浓度太低则扩增效率低。(2)引物的配制：厂家提供的引物一般是干粉状态并标明OD值，1OD约含33μg。开盖前先将干粉离心至管底，加双蒸水至浓度2μg/μl，再取局部稀释至10pmol/μl。引物浓度计算公式：1pmol=(3.3×10-4μg)×n，n是引物的碱基数(3)Mg2+：使用浓度一般在1.5mM，要求模板不含高浓度EDTA和诸如硫酸基团类的负电荷基团，Mg2+浓度升高可导致错配率升高和非特异性扩增。(4)模板DNA：浓度不可过高，质粒DNA20ng即可，假设需第二次扩增，可将第一次扩增产物稀释1000-10000倍作为模板使用。(5)TaqDNA聚合酶：一般用量5U/100μl。酶量过大易导致扩增非特异序列，Taq酶具有末端转移酶活性，常在3’端加A。2〕扩增轮数与退火温度扩增轮数：一般30轮以就可使模板扩增106倍，超过30轮，错配率升高。退火温度计算公式：Tm值=〔GC×4+AT×2〕–4琼脂糖凝胶电泳的检测(一)仪器1〕琼脂糖凝胶电泳系统〔天平、锥形瓶、量筒、微波炉、凝胶板、梳子、枪式移液器、灭菌Tip头、水平电泳槽、电泳仪〕2〕凝胶成像仪(二)试剂及材料目的DNA、琼脂糖、蔗糖、溴酚蓝、硼酸、Tris、EDTA、EB、DNA纯化试剂盒1)TAE电泳缓冲液浓储存液50×：242gTris；57.1ml冰乙酸；100ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)定容至一升。使用液1×：4.84gTris；1.15ml冰乙酸；2ml0.5mol/LEDTA(PH8.0)定容至一升。2〕样本液10×缓冲液:60%蔗糖；0.4%溴酚蓝〔三〕实验步骤1〕将有机玻璃槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，插好梳子，在梳子底部与胶槽之间应保持几毫米的间隙。2〕0.8%琼脂凝胶板的配制：取0.6g琼脂糖加80mlTAE〔1×〕，20ml水，微波炉加热融化3分钟，将其冷却至55°C-65°C，参加EB储存液1ul，小心混匀，缓慢倒入制胶槽中。〔根据目的基因的大小选择琼脂糖凝胶浓度〕。3〕充分凝固后从制胶槽中卸下凝胶板，放入电泳槽，参加TAE〔1×〕，使其液面略高于琼脂糖板，拨出样品梳。4〕DNA样品按照10：1的比例参加样本液，在腊面纸上混匀，用移液枪加样于琼脂糖板的样品孔中。同时另取一个DNA分子量标准上样于另一样品孔，在同一凝胶板上进展电泳。5〕接通电泳槽与电泳仪的电源，维持稳压1-5V/cm〔按照两极之间距离计算〕，电泳时间根据溴酚蓝指示剂迁移的位置来判断，当移动到距凝胶前沿1-2cm出停顿电泳。6〕剥胶并在凝胶成像仪观察结果。〔四〕技术要点1〕选择琼脂糖凝胶浓度取决于所鉴定DNA的大小，小片段DNA应用高浓度凝胶，大片段则用低浓度凝胶，在1%的琼脂糖凝胶中溴酚蓝的泳动速度与500bp的双链线状DNA一致。不同浓度琼脂糖凝胶及其可别离的线性DNA大小围见下表1。表1不同浓度琼脂糖凝胶及其别离线性DNA分子的有效围凝胶浓度〔%〕别离DNA的有效围〔kb〕0.360～50.620～10.810～0.81.07～0.51.26～0.41.53～0.22.02～0.12〕电泳中注意防止凝胶发热。3〕将电泳仪置稳压档，电压设置小于5V/cm〔电极间的最小路径〕。随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效别离围缩小。4〕溴化乙锭有强烈的致癌作用，操作时注意防护。四、目的DNA的回收纯化(一)仪器1〕琼脂糖凝胶电泳系统2〕凝胶成像仪3〕离心机4〕单面刀片5〕恒温水浴锅(二〕试剂1〕DNA回收试剂盒2〕50×TAEddH2O(三)实验步骤1〕在紫外灯下切分含DNA的琼脂糖块，尽可能除去多余的琼脂糖．放入1.5ml离心管中。2〕按每100mg琼脂糖参加300—600μl溶胶液的比例参加溶胶液〔本实验加500ul〕，置55℃水浴10分钟，使琼脂糖块完全溶化，期间每2分钟颠例混匀一次促溶。3〕将溶化后的琼脂糖液移入吸附柱，12000rpm室温离心1分钟，倒掉收集管中的液体．再将吸附柱放入同一个收集管中。4〕在吸附杜中参加500uI漂洗液，室温静置1分钟后，12000rpm室温离心30秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。5〕再在吸附柱中参加500uI漂洗液，12000rpm室温离心15秒，倒掉收集管中的液体，将吸附柱放入同一个收集管中。6〕12000rpm室温空离心1分钟。7〕将吸附柱放入一个干净的1.5ml的离心管中，在吸附膜中央参加30ul洗脱缓冲液，室温静置2分钟后，12000rpm室温离心1分钟〔为提高回收效率可再洗脱一次〕，将1.5ml离心管(DNA)贮存于-20℃。五、限制性切酶消化、产物回收及连接重组(一)仪器及材料1〕回收得到的目的DNA2〕BamHI、HindIII、T4DNA连接酶、DNA回收试剂盒3〕pUC18‐CAT质粒、双蒸水、10×酶切通用缓冲液K4〕EP管、恒温水浴锅、微量移液器、台式离心机表1常用酶切缓冲液配方缓冲液名称配方贮存温度〔℃〕10×L100mMTris-HCl,pH7.5100mMMgCl210mMDTT-2010×M100mMTris-HCl,pH7.5100mMMgCl210mMDTT500mMNaCl-2010×H500mMTris-HCl,pH7.5100mMMgCl210mMDTT1000mMNaCl-2010×K200mMTris-HCl,pH8.5100mMMgCl210mMDTT1000mMKCl-2010×T〔BSA－Free〕330mMTris-Ac,pH7.9100mMMgAc5mMDTT660mMKAc-200.1%BSA-200.1%Trition*-100-20(二〕实验步骤1〕在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反响体系：酶切反响体系〔20ul体系〕管号核酸10×酶切通用缓冲液KddH2OBamHIHindIII115ul目的DNA2ul0ul2ul1ul210ulpUC18‐CAT质粒2ul5ul2ul1ul2)37℃保温三小时。酶切产物的纯化回收，每100ul溶液参加700ul溶胶液，其余的操作步骤详见实验四载体与目的DNA的连接。在灭菌的EP管中按如下方式准备双酶切反响体系〔20ul〕：目的DNApUC18‐CAT质粒10×连接缓冲液T4DNA连接酶ddH2O*ulYul2ul1ulZul目的DNA和pUC18‐CAT质粒的相对浓度约为1:3—1:105〕14℃水浴保温过夜。大肠杆菌感受态细胞的制备及目的DNA的转化仪器小型高速离心机恒温摇床恒温培养箱‐20℃冰箱恒温水浴器超净工作台高压灭菌锅(二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．连接产物4．离心管枪头、微量移液器6．试管、培养皿、三角瓶(三)试剂LB培养基〔根据需要确定配制的量〕：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/LNaCl，加水至1000ml，高压灭菌，保存在室温。氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存。卡那霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保存无抗生素LB琼脂糖平板培养基〔根据需要确定配制的量〕：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。含有抗生素LB琼脂糖平板培养基〔根据需要确定配制的量〕：10g/l胰蛋白胨，5g/l酵母提取物，10g/lNaCl，15g/l琼脂粉，加水至1000ml，高压灭菌；当培养基降温至50℃左右，参加终浓度为100μg/ml的氨苄青霉素或50μg/ml卡那霉素，并铺平板，冷却后在37℃培养24小时，保存在室温。0.1MCaCl2〔根据需要确定配制的量〕：11.099克溶解在1000ml灭菌水中，0.22μm滤器过滤除菌。氯化钙分子量为：110.99。50％甘油：50ml甘油参加50ml水，混匀，高压灭菌。其他：DH5α大肠杆菌，灭菌玻璃平皿假设干，接菌环，加250mlLB液体培养基的1000ml灭菌锥形瓶一个，灭菌50ml和500mL离心管假设干，灭菌刻度吸管假设干，冰盒，移液器，灭菌移液器吸头，灭菌Eppendorf管等。〔四〕实验步骤1〕以接菌环从－70℃保存的高效转化菌种中蘸取少量菌液划无抗生素平板，培养12小时；2〕挑取单菌落接种于5mL无抗生素LB培养基中，37℃振荡培养过夜；3〕按照1:100接种菌液至250mLLB培养基中，37℃剧烈振荡培养1.5-2小时左右，至OD600达0.4-0.6；4〕将菌液冰浴10分钟，转移至预冷的500mL离心管中，4℃，4000rpm离心10分钟；5〕弃上清，将细菌沉淀重新悬浮于50mL预冷的0.1MCaCl2中，冰浴20分钟，4℃，4000rpm离心10分钟；6〕弃尽上清。以12.5mL〔菌液体积的5％〕预冷的0.1MCaCl2溶液重悬细菌沉淀，同时参加等体积预冷的50%甘油水溶液，混匀后按每支50μL在冰上分装，－80℃保存；注：以上操作全部在无菌条件下进展。7〕取连接产物2μl〔在实际操作中，经常需要取全部连接产物〕置于冰上；8〕从－80℃冰箱取3管感受态细菌〔每管50μl〕，在冰上融化；9〕将连接产物参加感受态细菌中，混匀，放置冰上20－30分钟；同时做两个对照管•受体菌对照：50μl感受态细胞+2μl无菌水•质粒对照：50μl0.1MCaCl2溶液+2μl连接产物10〕42℃加热90秒，迅速置于冰上1－2分钟；11〕每管参加400－1000μl的无抗生素液体LB培养基，在37℃摇床缓慢摇荡20－60分钟；12〕用<10000rpm离心10秒，弃去大局部上清，留下约50μl并用移液器吹吸重悬细菌；13〕取适量细菌悬液均匀的涂布在带有相应抗性〔根据质粒所携带抗生素抗性基因而定〕的LB琼脂糖平板上，倒置于37℃培养箱培养12小时以上，出现菌落。〔五〕技术要点1．参加的连接产物体积应该小于感受态细胞体积的5％；2．42℃热激时，必须要保证温度的准确性；3．涂布LB平板的菌液量应该根据经历确定。如果连接效率很高，而且所用感受态细菌的效率也很高，则吸取较少量的菌液；反之，可以增加，甚至全部菌液涂布平板。判断的标准：在LB平板上生长密度适宜的单菌落；4．涂布平板之后，在37℃培养的时间不超过12－16小时，否则可能产生卫星菌落；5．防止其它质粒污染；6．防止其它细菌污染。质粒DNA的提取及重组子的鉴定仪器恒温培养箱恒温摇床小型高速离心机高压灭菌锅分光光度计试剂及材料1.转化重组子2.缓冲液A：50mM葡萄糖；10mMEDTA；25mMTris-HCl，pH8.0。3.碱溶液：0.2MNaOH;1%SDS,PH12.5。4.乙酸缓冲液：3MNaAC；2M乙酸，pH4.8〔盐酸调pH〕。5.TE缓冲液：10mMTris-HCl，pH8.0；1mMEDTA.。6.RNA酶A溶液：10mg/mlRNA酶A，用TE配制，100°C煮10分钟，灭活DNA酶。缓慢冷却至室温，10000r/min离心5min,上清于-20°C保存。7.LB培养基:10g胰蛋白胨，5g酵母粉，5gNaCl加水至1000ml，用1MNaOH调pH至7.5，高压灭菌。8.氨苄青霉素：用去离子水配成100mg/ml的储存液，过滤除菌，－20℃分装保