实时定量PCR课件

1实时定量PCR

QuantitativeReal-TimePCR梁沛中国农业大学昆虫学系2主要内容基本原理几个概念绝对定量相对定量常见问题3一、基本原理4发展简史1993年，日本Higuchi等人首次采用动态PCR的方法和封闭式检测方式对目的核酸数量进行定量分析，首次提出了荧光定量PCR技术的概念。

荧光染料：EB（溴乙锭）

PCR仪：改良的热循环仪激发光：UV射线检测器：CCD相机缺点：仪器耗费巨大；非特异产物导致定量不准确5发展简史1995年美国PE公司成功开发TaqMan技术1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统优点：操作简单、快速方便、灵敏度高、重复性好、污染率低等6实时定量PCR的概念实时定量PCR技术（real-timequantitativePCR）

是指在PCR反应体系中加入荧光染料，实时监测整个PCR过程中荧光信号的累积强度，并利用特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法。RT-PCR：Reverse-transcriptionPCRqRT-PCR:quantitativeReal-timePCR78ABI7300荧光定量PCR仪ABI：Applied

Biosystems

Inc.9检测通道2004年推出的7300和7500均为第三代产品，2001推出的7900为第二代产品。7300：4通道7500：5通道均需加Rox染料进行校正1011两种荧光标记法1.染料染色

-SYBRGreenI

-EB2.探针标记

-Taqman

-TaqmanMGB

-分子信标12

SYBRGreenI的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm1.荧光染料法13化学原理14染料法的优缺点优点：实验设计简单，仅需要设计一对上下游引物，不需要设计探针，通用性好；成本低；可通过溶解曲线分析检验扩增产物的特异性。低通量实验一般优先考虑使用SYBRGreenI染料法。15染料法的优缺点缺点SYBRGreenI方法对PCR扩增特异性要求较高

SYBRGreenI可与所有的双链DNA相结合，因此由引物二聚体、单链二级结构以及错误的扩增产物引起的假阳性会影响定量的精确性SYBRGreenI不能区分不同扩增片段发出的荧光而导致它不能用于多重反应

162.荧光探针法(Taqman)17TaqmanProbeQuencherReporter18Tagmanprobe的工作原理19探针与PCR产物的数量关系每产生一个新的DNA片段，就切断一条探针每切断一条探针，就产生一个单位的荧光信号信号强度与DNA的copy数成正比20探针法的优缺点优点：Tagman探针法中，除引物外，还使用了一条特异的探针，因此此方法可以特异的检测目标序列，防止非特异产物的干扰影响定量的准确性可用于多重反应，即可同时检测多个目的基因。缺点：但探针设计成本较高，有时探针设计困难。21二、几个概念221.扩增曲线描述PCR动态进程的曲线称为扩增曲线。PCR的扩增曲线实际上并不是一条标准的指数曲线，而是呈S型曲线CyclesFluoresces231.扩增曲线扩增曲线分三个阶段：荧光背景信号阶段(基线期)：扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，无法判断产物量的变化。荧光信号指数扩增阶段（对数期），PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可选择该阶段进行定量分析。在平台期：扩增产物已不再呈指数级的增加。PCR的终产物量与起始模板量之间没有线性关系，所以根据最终的PCR产物量不能计算出起始DNA拷贝数。242.荧光阈值一般把荧光PCR的前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline，基线期），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值，扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖。是人为设定的一个值，可设在指数扩增阶段任意位置上。缺省设置是3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍（自动）。2.荧光阈值25262.荧光阈值手动设置，原则：大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值，同时要尽量选择进入指数期的最初阶段，真正的信号是超过域值的荧光信号。273.

Ct值Cyclethreshold，就是当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的循环次数。线性图谱半对数图谱Ct值Ct值28Ct值的重现性293.

Ct值Ct值与模版的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，达到阈值所需的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。正常的Ct值范围在18-30之间，过大和过小都将影响实验数据的精度。3031Ct值定量的数学原理×32Ct值定量的数学原理×33Ct值定量的数学原理34Ct值定量的数学原理Threshold10410310235靶标基因的定量36靶标基因的定量50001000012需要制备标准品需制作绝对标准曲线无需标准品，需制作相对标准曲线37靶标基因的定量CYP6B6ActinNorthernblot半定量PCR38三、绝对定量39三、绝对定量40三、绝对定量标准品的一些标准：必需用与扩增目的基因相同的引物进行扩增，并且扩增效率相同标准品必需是经过准确定量的（例如，用分光光度计定量）标准品必需是标准化的（例如，同一化的细胞数）在每组实验时，标准品和待测样品必需用相同的阈值来确定Ct值41三、绝对定量标准品的制备方法：1.化学合成目的基因，优点是纯度高、定量准确

缺点是受化学合成工艺限制，只能合成120bp以下的长度；2.回收纯化PCR产物后克隆到载体上，然后抽提质粒，经过测量浓度和拷贝数的换算，可准确定量

优点是稳定、准确。42三、绝对定量标准品倍比梯度稀释方法：10v原液(标准品i)+90v稀释缓冲液，得标准品ii10v标准品ii+90v稀释缓冲液，得标准品iii10v标准品iii+90v稀释缓冲液，得标准品iv10v标准品iv+90v稀释缓冲液，得标准品v

Why?43三、绝对定量拷贝数的计算(以dsDNA为例）待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×50×稀释倍数样本分子量=碱基数×660dalton/bp待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本质量/样本分子量×6×101444三、绝对定量拷贝数的计算举例：3000碱基质粒，浓度100ng/ulMW=3000bpx660dalton/bp=1.98x106daltons。copy数＝--------------×6×1014

＝3x1010copies/ul100ng1.98x10645绝对定量举例Copies/ulCt1Ct2MeantCtSTD5×10328.1828.6428.410.165×10425.2525.1425.190.045×10522.1122.4622.280.125×10618.6318.9218.770.10Blank－－棉铃虫Cyp6B2基因拷贝数检测46绝对定量举例扩增效率（E）计算E=10-1/斜率

=10-1/-3.18=2.06E%=(2.06-1)×100%=106%47绝对定量举例如未知样本Ct为20.5，将Ct值带入线性方程：20.5=-3.183X+40.211X=（20.5-40.211）/-3.183=6.19未知样本拷贝数=106.19

=1548816copies/ul48四、相对定量无需知道目的基因的绝对拷贝数需要注意的问题：

1.模板均一性问题：起始的细胞数、细胞的状态、均一性等

2.RNA制备：RNA纯化得率、均一性等

3.反转录：反转录的效率等49内标/内参照因RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度可能不同。因此，在进行基因表达研究中都会用看家基因（house-keepinggene）对数据进行标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有：GAPDH、Beta-actin、18SrRNA等50相对定量的方法双标准曲线法△△Ct法51双标准曲线法优点：分析简单，实验优化简单。缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线；必需有固定的标准品做标准曲线；这些标准品并不代表样品扩增的真实状态比如标准品为质粒或纯化的PCR产物，而待测样品为cDNA，那么标准曲线的扩增效率并不能真实地反映样品的扩增情况。应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一。处理组目的基因表达量处理组参照基因表达量对照组目的基因表达量对照组参照基因表达量相对表达量＝52△△Ct法△Ct，即Ct的变化值假定目的基因和参照基因的扩增效率相同，均为100%＝2-(△Ct1-△Ct2)＝2-△△Ct53△△Ct法－举例Cyp6B6aveCt18SRNAaveCt标准化的Cyp6B6△Ct校正△△Ct处理组22.812.310.5-1.4对照组24.512.611.90因此，处理组Cyp6B6基因的表达量是对照组的2-△△Ct=2-（-1.4）＝21.4＝2.64倍54△△Ct法优点：优化的体系建立后，每次实验中无需再对看家基因和目的基因做标准曲线，而只需对待测样品分别进行PCR扩增即可。要求：标准曲线斜率差值<0.1缺点：假定扩增效率为100%；假定标准曲线及每次扩增之间的效率都保持一致；实验条