体内药物分析 第四章方法的建立与验证

第四章

体内药物分析

方法的建立与验证药学院药物分析教研室10/7/20231体内药物分析分析方法的设计依据分析方法建立的一般步骤分析方法验证的内容与要求体内药物分析应用示例本章内容提要10/7/20232体内药物分析【大纲要求】1、掌握体内药物分析方法的评价2、熟悉体内药物分析方法建立的思路、分析方法建立的一般实验步骤10/7/20233体内药物分析第一节

分析方法的设计依据建立分析检测方法的主要依据待测药物的理化性质及在生物体内的存在状况分析测定的目的与要求生物样品的类型与预处理方法实验室条件第四章分析方法的建立与验证10/7/20234体内药物分析一、待测药物的理化性质及体内存在状况准确测定生物样品中的药物或其特定代谢物通过一定的生物样品预处理使待测物从结合物或缀合物中释放出来。故此，应首先考虑样品预处理方法 待测药物的理化性质 药物在生物体内的存在状况 药物在生物体内的生物转化(代谢)途径第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/20235体内药物分析(一)待测药物的理化性质

药物的pKa值、亲脂性、溶解度、分配系数等—预处理及检测方法 具有亲脂性—在适当的pH值下用溶剂萃取 具有强极性或亲水性—沉淀蛋白、固相萃取、离子对萃取或衍生化后萃取等 具有挥发性—GC测定法 具有光谱或电化学特性—分析检测方法 药物的稳定性—萃取浓缩技术 对酸碱不稳定—避免使用强酸或强碱性溶剂 对热不稳定—避免高温蒸发溶剂第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/20236体内药物分析(二)待测药物的体内存在状态

与血浆蛋白结合的强弱及结合率的高低 —分离萃取方法

蛋白结合较强—不宜直接采用溶剂萃取

体内浓度高低、代谢过程及其代谢产物

—分析检测技术

浓度较低（尤其有代谢产物共存） —代谢产物的干扰与特定代谢产物的同时测定 —采用LC-MS等分析检测技术第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/20237体内药物分析二、分析测定的目的与要求

体内药物分析的目的—影响分析方法的应用

药代动力学—研究药物在体内吸收、分布、代谢和排泄过程—血浆浓度随时间的变化过程；代谢途径及代谢产物

要求—同时测定原形药物和代谢产物

检测—宽线性范围(Cmax～Cmax的1/20)、高灵敏度(10-9g/ml)和高专属性(分离能力)(原形药物及其代谢产物的分离)

方法—不必强调方法的简便、快速，大多采用色谱及其脱线或在线联用技术，如HPLC、LC-MS第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/20238体内药物分析二、分析测定的目的与要求

临床治疗药物监测

有效治疗浓度范围内药物浓度

方法—尽量简便、易行；适用于长期、批量样品的测定，大多采用UV、RIA或EIA等。

中毒患者的临床抢救

药物浓度极高

方法—不必强调方法的灵敏度，强调方法的特异性和分析速度 —大多采用色谱及其联用技术GC、GC-MS、RIA或EIA第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/20239体内药物分析三、生物样品的类型与预处理方法 生物样品的类型与预处理方法—决定分析方法的应用

以血浆或血清为分析样品

采用蛋白沉淀-溶剂萃取预处理技术 —分析样品较为“干净”，可用HPLC检测

用RIA分析 —样品的预处理方法可较为粗放 —经过简单的蛋白沉淀或不经任何预处理直接测定第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/202310体内药物分析四、实验室条件 在设计体内药物分析方法时，还应充分考虑到实验室现有的或有可能在其它实验室使用的仪器装备，合理选择可行的分析方法。第四章分析方法的建立与验证第一节分析方法的设计依据10/7/202311体内药物分析第二节分析方法

建立的一般步骤一、分析方法的选择二、分析方法的建立

(一)

检测条件的筛选

(二)分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证10/7/202312体内药物分析一、分析方法的选择

体内药物分析方法的设计 生物样品中的药物浓度—决定分析方法的首要因素 生物样品中药物或其特定代谢产物的浓度低、样品量少 —难以通过增加取样量提高方法灵敏度 —通过选择适当的分析方法适应样品分析需求体内药物分析中常用分析方法—特点见表4-1第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202313体内药物分析二、分析方法的建立分析方法建立之前 查阅文献资料—充分了解药物在体内的动力学过程

—避免受到代谢产物的干扰，选择适用于实际生物样品测定的方法第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202314体内药物分析/index.asp10/7/202315体内药物分析/index.htm10/7/202316体内药物分析/10/7/202317体内药物分析http://www.tandf.co.uk/journals//home/main.mpx10/7/202318体内药物分析/sites/entrez?db=pubmedMedline10/7/202319体内药物分析/10/7/202320体内药物分析10/7/202321体内药物分析二、分析方法的建立初步拟定分析方法后 进行一系列试验工作—选择最佳分析条件

同时验证分析方法的可行性—确认是否适用于实际生物样品分析方法的建立和验证过程是不可截然划分的分析方法的建立步骤第一步：检测条件的筛选第二步：分离条件的筛选第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202322体内药物分析(一)检测条件的筛选

标准物质—照拟定的分析方法(不包括生物基质的预处理)测定—确定最佳分析检测条件(如色谱条件)和检测灵敏度

HPLC—调整检测器(类型、条件)、色谱柱(型号、牌号、填料性状与粒经、柱长度)、流动相(组分及其配比)及其流速、柱温、进样量、内标物质的浓度及其加入量等—使各物质具有足够的方法灵敏度(LOQ) 良好的色谱参数(n、R、T) 适当的保留时间(tR)第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202323体内药物分析(二)分离条件的筛选

在进行分离条件筛选时，应考察生物基质中的内源性物质及代谢产物对分离与检测的干扰，步骤如下：

1．空白溶剂试验—溶剂(方法特异性) 2．空白生物基质试验—(方法特异性) 3．模拟生物样品试验—方法效能指标 4．实际生物样品测试—代谢产物(方法特异性)第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202324体内药物分析1．空白溶剂试验

待测药物的非生物基质溶液（通常为水溶液） —采用拟定的分析方法进行衍生化反应、萃取分离等

样品预处理（反应试剂、衍生化试剂、萃取溶剂等） —测定响应信号（如HPLC峰面积或峰高） 考察目标 —方法的特异性 —空白值应尽可能小，并能有效校正第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202325体内药物分析对色谱分析法而言

—可通过改变反应条件、萃取方法或萃取条件（萃取溶剂的极性、混合溶剂的配比，固相萃取填料性质、冲洗剂与洗脱剂及其用量等），甚至检测器类型 —空白试剂信号应不干扰药物的测定（如R＞1.5）

本步骤主要考察 —需经化学反应的预处理过程，若预处理过程仅为生物样品的提取分离，则可不进行该步骤，直接进行空白生物基质试验第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202326体内药物分析2.空白生物基质试验

空白生物基质(blankbiologicalmatrix) —如空白血浆 —照“空白溶剂试验”项下方法操作 考察目标

—生物基质中内源性物质对测定的干扰（方法特异性） —在待测药物(或特定的活性代谢物、内标物质等)的“信号窗”内不应出现内源性物质信号第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202327体内药物分析10/7/202328体内药物分析10/7/202329体内药物分析3.模拟生物样品试验

模拟生物样品(质量控制,QC样品)—空白生物基质中加入待测药物，照“空白溶剂试验”项下方法操作

考察目标： —方法的线性范围、精密度与准确度、灵敏度 药物的萃取回收率等各项技术指标—同时进一步检验生物基质中内源性物质以及可能共同使用的其他药物对测定的干扰程度，即方法特异性第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202330体内药物分析对色谱分析法而言

—进一步考察待测药物(或内标物)与内源性物质(或其它药物)的分离情况 —色谱峰的tR、n和T是否与水溶液的一致 色谱峰是否为单一成分（如何确定？） 标准曲线的截距是否显著偏离零点等 —内源性物质是否对待测药物或内标物质构成干扰第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202331体内药物分析Blankplasma10/7/202332体内药物分析BlankplasmaspikedwithSt.andIS10/7/202333体内药物分析10/7/202334体内药物分析4.实际生物样品的测试

空白生物基质和模拟生物样品试验—确定的分析方法及其条件 —不能完全确认是否适合于实际生物样品的测定 —药物在体内可能与内源性物质结合(如血浆蛋白结合物)或代谢生成数个代谢产物及其进一步的结合物(或缀合物) 实际生物样品—确立分析方法后，尚需进行实际生物样品的测试 考察目标：—代谢产物对药物、内标物质的干扰情况—进一步验证方法的可行性第四章分析方法的建立与验证第二节分析方法的建立步骤10/7/202335体内药物分析anextractedplasmasamplefromahealthysubject(6hafteroraladministrationoforphenadrine)10/7/202336体内药物分析10/7/202337体内药物分析10/7/202338体内药物分析10/7/202339体内药物分析10/7/202340体内药物分析10/7/202341体内药物分析10/7/202342体内药物分析10/7/202343体内药物分析第三节分析方法

验证的内容与要求

基于以下原因需要对建立的分析方法学进行验证：1、生物样品量少2、浓度低3、内源性物质的干扰4、生物的个体差异较大10/7/202344体内药物分析

用于实际生物样品分析之前： 需要验证(validation)分析方法的可行性与可靠性 方法验证时应考虑影响分析方法的所有可变因素：

采样、样品制备、色谱分离、检测与数据评价

使用的技术指标 —效能指标

使用的样品

—通常采用模拟生物样品和用药后的实际生物样品第四章分析方法的建立与验证10/7/202345体内药物分析验证步骤

首先为分析方法的验证 —特异性、精密度与准确度、回收率、定量限与检测限、溶液稳定性

其次为生物基质中待测药物稳定性的验证 —室温放置、冷冻（或冷藏）、冻-融循环Freeze-and-thawcycle第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202346体内药物分析验证的效能指标与基本要求

1．特异性（专属性）—避免干扰 2．标准曲线与线性范围—覆盖所有浓度范围 3．准确度—与实际状况相符 4．精密度—结果可重现 5．定量限—达到峰浓度的1/10～1/20 6．稳定性—确保所有样品准确测定 7．提取回收率—确保准确度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202347体内药物分析一、方法特异性(专属性或选择性)

方法的特异性(specificity) —又称专属性或专一性，通常与选择性(selectivity)互用 —系指当有内源性物质存在时，方法准确测定待测物质的能力 专属性—表示所检测的信号(响应)系属于待测药物所特有 选择性—系指将待测物质与其代谢物及同服的其它药物加以区分(分离)的能力

特异性—函盖二者，以验证所测定的物质与待测药物的同一性 考察一个分析方法是否具有特异性，应着重考虑以下几点：第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202348体内药物分析1.内源性物质的干扰

比较—待测药物或其活性代谢产物检测信号 对照品（或标准品） 空白生物基质 模拟生物样品（空白生物基质中添加对照品） —如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致 及与内源性物质色谱峰的R 确证—内源性物质对分析方法有无干扰第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202349体内药物分析2.代谢产物的干扰

比较模拟生物样品和用药后的实际生物样品的检测信号与代谢产物的R 如HPLC色谱峰的tR、n和T〔或改变色谱条件(色谱柱)再比较〕来确证其它代谢产物对分析方法有无干扰

结构已知的特定活性代谢物的测定 －通过HPLC-DAD和LC-MS确证色谱峰的单纯性和同一性

对于结构未知的代谢产物的测定 －采用LC-LC-NMR进行结构的初步推测后，考察其干扰情况第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202350体内药物分析3.联合药物的干扰

TDM时 —还要考虑患者可能同时服用药物的干扰 通过比较待测药物及可能同时服用药物的模拟生物样品的检测信号 如HPLC色谱峰的tR、n和T是否一致

来确证同时服用药物对分析方法的干扰情况第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202351体内药物分析4.与参比方法的相关性

除上述方法外，有时还可使用参比方法对照 参比方法一般选用特异性强、准确度高、线性关系良好的色谱法，如在TDM中使用UV(或RIA)时,可以HPLC(或GC)为参比 参比方法测定结果为横坐标(X);拟定方法结果为纵坐标(Y) 用最小二乘法计算回归方程Y＝a＋bX(坐标标度相等)、相关系数(r)—表示两种方法测得结果的一致性，若r≠1，表示拟定方法为非线性，如RIA中抗血清滴度选择不当第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202352体内药物分析4.与参比方法的相关性

Y＝a＋bX截距(a)—表示拟定方法受到恒定干扰的程度—内源性物质(UV) 斜率(b)—表示拟定方法受到比例干扰的程度—标记抗原不纯(RIA) 与参比方法的相关性比较—除显示分析方法的特异性外 —斜率b表示两种方法测得结果的一致性

若参比方法准确度良好，且截距a≈0,则拟定方法的准确度(回收率)为100b(%)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202353体内药物分析二、标准曲线与线性范围

标准曲线（standardcurve）—calibrationcurveorworkingcurve —生物样品中所测定药物浓度与响应的相关性（比例的程度） —通常用回归分析方法所得的回归方程来评价 —除少数方法（免疫分析法）外，标准曲线通常为线性模式 —回归分析法为最小二乘法（leastsquares）或加权最小二乘法（weightedleastsquares） 线性范围（linearrang）—标准曲线的最高与最低浓度的区间 —模拟生物样品的测定结果应达到试验要求的精密度和准确度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202354体内药物分析二、标准曲线与线性范围(续)

标准曲线—用模拟生物样品建立 —线性范围(不包括零点)应能覆盖全部生物样品中的药物浓度 —不能使用外推的方法求算未知生物样品中的药物浓度

建立标准曲线所使用的模拟生物样品应使用与待测的含药生物样品相同的生物基质制备第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202355体内药物分析标准曲线的一般建立方法标准系列溶液的制备内标溶液的制备标准系列模拟生物样品的制备标准曲线的绘制加权最小二乘法限度要求10/7/202356体内药物分析标准曲线的一般建立方法

1.标准系列溶液的制备标准物质－对照品、标准品 溶剂—水或甲醇（或其他适当溶剂） 浓度—模拟生物样品中药物浓度的50倍以上 加入量为生物样品总体积的2%以下 避免标准模拟生物样品与实际样品存在较大差异 浓度较低—应除去溶剂后再加入生物基质 否则,在实际样品测定时应加入等体积的溶剂并涡旋混匀

第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202357体内药物分析

至少含5～8个浓度点(不包括零点,即空白) —可覆盖全部待测生物样品中的药物浓度 如：1、2、5、10、20、50、100(等比梯度模式—比例常数约为2) 若体内平均达峰浓度为50，其1/20为2.5 设定最高浓度为100，最低浓度为1(个体差异)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202358体内药物分析2、内标溶液的制备内标物质－对照品、标准品或化学试剂适宜的溶剂－甲醇、水、乙腈或混合溶剂浓度－与标准系列溶液的中间浓度相当如：某标准溶液5、10、20、40、80、160、320μg/ml，则内标的浓度应配制成40μg/ml10/7/202359体内药物分析3.标准系列模拟生物样品的制备

空白生物基质(如血浆)—加入标准系列溶液适量，涡旋混匀 为防止在标准溶液加入及涡旋混合时造成的损失 ——①先加入标准溶液②再加入空白生物基质 ③涡旋混匀①②③第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202360体内药物分析实验中的注意事项：1、标准模拟生物样品的最高浓度应高于生物体用药后的达峰浓度，最低浓度应低于最高浓度的10％～5％。2、应先在离心试管中加入标准溶液，再加入空白生物基质后混悬3、标准溶液加入到试管中后，应先挥干溶剂再加入空白生物基质。10/7/202361体内药物分析4.标准曲线的绘制

以待测药物的检测响应(如色谱峰面积或峰高)或与内标物质的检测响应的比值(内标法)(因变量,y)对模拟血药浓度(自变量,x) —求得回归方程(y＝a＋bx)及其相关系数(

) 在一组由至少7个浓度(不包括零点)构成的标准曲线中，至多可有2个浓度点数据，可予剔除。但应有确切原因，如： （1）样品处理有损失；（2）色谱图有问题；（3）显著偏离标准曲线 —其余应有至少5个浓度点在标准曲线上第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202362体内药物分析5.加权最小二乘法

普通最小二乘法—每个浓度点绝对误差(yi－yi’)赋予同等的重要性

标准曲线上的高低浓度相差悬殊(范围达102) —低浓度区的计算值相对误差过大，难以满足规定要求。加权最小二乘法—回归计算时增加一个权重因子(w) —各浓度的响应值与回归值的相对离差平方和达到最小式中，wi为标准曲线上第i个浓度点的权重因子第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202363体内药物分析1）回归方程(y=a+bx)参数的计算

第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202364体内药物分析2）权重因子的选择

加权—赋予低浓度点以更大的权重 在实际工作中的一般方法 （1）当wi=1/(yi’)2时，则 （2）而yi与xi成正比 （3）所以，令wi=1/(bxi)2=k/xi2(通常取wi=1/C2)

当高浓度点测量值的准确度下降过大 低浓度点权重过大，降低低浓度点的权重，wi=k/xi第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202365体内药物分析标准曲线的限度要求

药代动力学或生物利用度研究 —标准曲线至少包括5个浓度(通常为5～8个浓度,不包括零点) —最高浓度应高于达峰浓度(Cmax)；最低浓度应低于Cmax的10%～5%，并应为方法的LOQ(非LOD) —回归方程的截距应接近于零，b≥使之具有较高的灵敏度 —相关系数要求

≥0.99(色谱法)或≥0.98(生物学方法) —若非线性，可分为高低两个浓度区间(每个区间不少于5个浓度)，分别加权回归—如1、2、5、10、20和10、20、50、100、200第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202366体内药物分析三、准确度

方法准确度(accuracy) —系指用该方法测得的生物样品中待测药物的浓度与其真实浓度的接近程度 —应使用实际生物样品测定，但实际生物样品的浓度是未知的所以，通常使用模拟生物样品测定 —一般用相对回收率(relativerecovery，RR)或相对误差(relativeerror，RE)表示第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202367体内药物分析1.测定法

取空白生物基质（如血浆）数份，照标准曲线项下方法操作，用标准曲线计算 在标准曲线范围内制备质控(qualitycontrol，QC)样品 —高(接近上限)、中、低(接近LOQ)3个浓度 —每一浓度至少5个样本 —与随行的标准曲线同法测定、计算，每个样品分析测定1次

第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202368体内药物分析2.结果计算与限度要求

计算 —测定值M(measured)的平均值与理论浓度(加入值)A(added)比值 相对回收率 相对误差 限度要求 —相对回收率应在85%～115%(LOQ附近80%～120%) —RE在±15%(LOQ附近为±20%)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202369体内药物分析10/7/202370体内药物分析四、精密度

方法精密度(precision) —系指每次测定结果与多次测定的平均值的偏离程度 —表示该分析方法的可重复性(reproducibility) —反映分析方法的可操作性，是方法验证的基本要点之一 实际生物样品的量有限(如血浆，一般为0.5～2ml) —使用模拟生物样品测定第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202371体内药物分析1.表示方法

方法精密度一般用标准偏差(standarddeviation，SD)或相对标准偏差(relativestandarddeviation，RSD)表示SD= RSD= =批内(within-run或intra-assay)RSD—日内(within-day)批间(between-run或inter-assay)RSD—日间(between-day，day-to-day)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202372体内药物分析2.测定法—分别测定法(Ⅰ)

照准确度项下方法，取空白生物基质(如血浆)数份，分别在同一批内和不同批间制备高、中、低3个浓度的QC样品，并分析测定

批内RSD —每一浓度5～6个样品，每个样品测定1次，用随行标准曲线分别计算3个浓度及每1浓度的RSD

批间RSD —每1分析批内每一浓度制备1个样品，每个样品测定1次；用随行标准曲线计算3个浓度(每一浓度5～6个分析批数据)的RSD第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202373体内药物分析2.测定法—连续测定法(Ⅱ)

若实际样品测定所用的分析批次少于5批，也可进行3个批次的连续分析(每1浓度的每1批次为5～6个样本)—方差分析法 批间RSD= 批内RSD= =第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202374体内药物分析3.限度要求

在药代动力学和生物利用度研究中

对

g/ml级水平的RSD一般应≤10% ng/ml级水平的RSD一般应≤15% 在LOQ附近RSD应≤20%。

第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202375体内药物分析10/7/202376体内药物分析五、定量限

方法定量限(limitofquantitation，LOQ) —系指在保证具有一定可靠性(准确度与精密度符合要求)的前提下，能测定出生物样品中药物的最低浓度,又称为方法灵敏度(sensitivity) —标准曲线上的最低浓度点(最低浓度点≥LOQ)

要求—应能满足测定3～5个消除半衰期后生物样品中的药物浓度或Cmax的10％～5％) —准确度在80%～120%(或RE在±20%的范围内) —RSD≤20%第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202377体内药物分析最低检测限（limitofdetectionLOD）：是指可在噪音水平下识别样品中药物的最低浓度，一般认为信噪比（S/N）≥3，信号可被检测，故以S/N）＝3时的样品浓度作为LOD.LOQ的检测信号至少是LOD的2倍以上，以（S/N）＝10作为LOQ的估计值。10/7/202378体内药物分析LODTestS/N＝310/7/202379体内药物分析六、稳定性在生物样品的分析中，需要对样品的存放条件和时间进行考察，以保证分析结果的准确、可靠

方法稳定性考察

生物样品的稳定性考察

相关稳定性的测定方法与要求10/7/202380体内药物分析方法稳定性：主要考察待测药物的标准品溶液在实验室温度、湿度、光照及空气等条件下的稳定性在分析方法的建立时要考虑模拟生物样品的预处理及待测物在室温或冰箱中存放的稳定性10/7/202381体内药物分析生物样品的稳定性短期稳定性主要考察模拟生物样品在室温、4℃或－20℃以及冻－融循环条件下的稳定性长期稳定性主要考察生物样品长期冰冻（－20℃或－80℃）后的稳定性10/7/202382体内药物分析测定方法与要求1、取高、中、低三个浓度的QC样品，在不同条件下存放不同时间后，每个样品重复测定三次，平均值应为零时测定的±5％以内（经衍生化处理±15％以内）。若考察时间大于1天，则应与新制QC样品比较，若考察时间很长，可与反复在液氮中保存的样品在相同条件下的测定值比较2、稳定性期限要求室温下－1个工作日（1、2、4、8、24）冰箱中－数个工作日（数星期、数月）10/7/202383体内药物分析七、萃取回收率

生物样品的预处理方法（1）方法准确度(或相对回收率，relativerecovery)，操作简便、快速（2）萃取回收率(绝对回收率，absoluterecovery)，≥70%萃取回收率与相对回收率的比较（1）萃取回收率主要考察生物样品预处理过程造成的药物的程度损失（2）相对回收率主要用来考察测定方法的准确度，采用标准曲线可准确计算生物样品中药物浓度第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202384体内药物分析1.测定法

取空白生物基质(如血浆)，制备高、中、低3个浓度的QC样品(每一浓度至少5个样品)，每个样品分析测定1次 另取等量的相同3个浓度的标准溶液，用溶解模拟生物样品经提取处理后的残渣的溶剂稀释至同体积，同法测定

AT—经萃取后的QC样品的检测信号或比值(内标法) AS—未经萃取的标准溶液的检测信号或比值(内标法)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202385体内药物分析实验过程中的注意事项1、要考察是内源性物质还是提取方法对提取回收率产生影响2、如采用内标法定量时，内标应在提取之后，溶剂蒸发之前加入3、采用内标法定量时，应同时测定内标物质的提取回收率，只需配制一个中间浓度的QC样品5份10/7/202386体内药物分析2.限度要求在生物利用度或TDM时高、中、低浓度样品的萃取回收率一般应≥50%高、中浓度的RSD应≤15%低浓度的RSD应≤20%内标法中内标物质的提取回收率应≥50%（RSD≤15%)第四章分析方法的建立与验证第三节分析方法的验证与要求10/7/202387体内药物分析10/7/202388体内药物分析八、质量控制该内容主要目的是用来在实际生物样品的测定过程中对分析数据的质量进行监控1、质控样品（QualitycontrolQC）：是指将已知量的待测药物加入到空白生物基质中配制的模拟生物样品，用于整个分析过程中的质量控制，一般配制高、中、低三个浓度的样品质控样品池由不负责生物样品测试的人员在实验开始时制备，并与实际生物样品在相同条件下储存10/7/202389体内药物分析2、质量控制（1）测定法：在测定过程中，每批生物样品都应建立随行的标准曲线，并随行间隔以高→低或低→高测定高、中、低至少3个浓度的6个QC样品（2）限度要求：6个QC样品中至少4个的测定结果的准确度在各自正常浓度80％～120％，RSD≤20%,允许由2个QC样品超出各自的±20％10/7/202390体内药物分析九、生物样品测定中其它需要注意的事情1、干扰性内源性物质的排除方法2、测定方法的再评价或交互验证3、实际生物样品浓度超出线性范围的处理10/7/202391体内药物分析合适的空白生物基质的制备方法：1、对生物基质进行处理2、使用不含内源性物质的生物基质3、使用替代基质10/7/202392体内药物分析方法的再评价或交叉验证：1、改变色谱条件或生物样品的处理方法－样品的前处理方法改变后需要对效能指标进行重新考察2、改变生物基质－不同物种的生物基质进行同一药物的PK实验时，需要进行方法的再评价10/7/202393体内药物分析实际浓度超出标准曲